不同途徑注射地塞米松對2型糖尿病大鼠房水藥物濃度和血糖的影響

沈燕燕，黃 亮，晏 立，吳曉蓉，邵 毅，梅 鋒

0引言

糖尿病視網膜病變(diabetic retinopathy，DR)是2型糖尿病(diabetes mellitus，T2DM)最常見和最嚴重的微血管并發癥之一[1]。許多研究已經證明炎癥反應在T2DM患者微血管病變的發生中起著關鍵作用[2-3]。地塞米松具有抗炎作用，其已在眼科臨床中用于治療DR[4-5]。全身使用糖皮質激素可導致T2DM患者出現血糖(blood sugar，BS)升高、消化性潰瘍及骨質疏松等一系列副作用[6]，局部使用糖皮質激素也可導致血糖升高[7]。此外，有研究發現眼局部注射地塞米松可使血糖升高[8]。眼部地塞米松常用給藥途徑包括局部點眼、眼周注射、玻璃體腔注射。局部點眼由于滴眼液在眼表面常被快速引流，同時受到淚膜、角膜、結膜上皮屏障的阻擋，造成藥物吸收時間短、局部濃度低、生物利用率低[9]，效果持續時間短，從而無法到達眼后節發揮治療作用。玻璃體腔注射易出現眼內炎癥、孔源性視網膜脫離、眼壓升高、眼部出血等并發癥[10]。眼周注射在結膜或筋膜組織下注射的藥物有效地繞過了表面的淚膜和結膜屏障，且能夠在組織層之間的潛在空間內留下大量的藥物并將藥物運送到后段，是較為理想的給藥途徑。為此，本研究通過結膜下、球旁、球后注射三種途徑注射地塞米松，觀察三種途徑注射后對T2DM大鼠房水藥物濃度和血糖的影響，以期為臨床更好地使用地塞米松提供思路。

圖1地塞米松磷酸鈉和潑尼松質譜檢測質荷比A：地塞米松磷酸鈉；B：潑尼松。

1材料和方法

1.1材料實驗動物：清潔級4周齡SD雄性幼鼠240只，體質量180～220g，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供[SCXK(湘)2016-0002]，自由攝食飲水，自然光照，保持安靜，室溫26℃，分籠飼養。主要試劑：鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ，美國SCE公司)，地塞米松磷酸鈉注射液(河南潤弘制藥股份有限公司，國藥準字H41020327)，地塞米松磷酸鈉標準品(批號C101069215，中國食品藥品檢定研究院)，潑尼松(批號C10016502，中國食品藥品檢定研究院)，甲醇和乙腈為分析純。主要儀器設備：血糖監測儀(江蘇魚躍醫療設備股份有限公司)，液相-質譜聯用儀(LCMS-2010EV，日本島津)。本研究符合動物倫理學標準且得到我院倫理委員會批準。

1.2方法

1.2.1 T2DM大鼠模型建立SD大鼠(n=240)普通飼料(碳水化合物60%、蛋白質22%、脂肪10%、其它8%，由南昌大學動物科學部提供)適應性喂食1wk，然后高糖高脂飼料(蛋白質19.8%、碳水化合35.2%、脂肪45.0%，由北京博泰宏達生物有限公司提供)喂養6wk，禁食24h，腹腔注射亞致病劑量STZ(按30mg/kg劑量給藥，STZ臨用前以pH4.2，0.01mmol/L枸櫞酸緩沖液配成30g/L濃度，置于冰浴上操作)，間隔2d再注射1次，第2次注射STZ 72h后，血糖濃度>16.7mmol/L者即為T2DM大鼠模型。本研究中2次STZ腹腔注射后，192只SD大鼠血糖濃度明顯升高(25.22±7.78mmol/L)，且出現緩慢的消瘦、飲食大幅增多，24h尿量明顯增多，部分大鼠出現爛尾現象，具有糖尿病典型的“三多一少”臨床表現，說明T2DM大鼠模型建立成功。

1.2.2動物分組和藥物處理將造模成功的T2DM大鼠(n=192)隨機分為實驗組(n=96，注射地塞米松)和對照組(n=96，注射生理鹽水)，每組T2DM大鼠根據給藥途徑不同隨機分為3個亞組，即球旁注射組、球后注射組、結膜下注射組，每個亞組T2DM大鼠32只，其中24只用于房水藥物濃度測量，8只用于血糖濃度測量。禁食不禁水12h后，T2DM大鼠左下腹腔乙醇消毒后，腹腔注射10%水合氯醛無菌溶液(0.3mL/100g)麻醉。實驗組大鼠根據分組給予地塞米松磷酸鈉注射液0.1mL[11]，對照組大鼠根據分組給予生理鹽水0.1mL。

1.2.3血糖濃度測定注射開始后大鼠禁食不禁水，每個亞組隨機選取大鼠8只，每只大鼠分別于注射0、2、4、8、12、24h連續尾靜脈穿刺采血，測定血糖濃度(試紙法)。

其次是理解信息。理解信息是在通讀全文后，針對某一句話，放入語境中理解語義，這也需要對專業術語有深入了解，需要翻譯者有較強的英語思維，跨越文化差異帶來的影響，將特定情境下的語義正確的表達出來。

1.2.4房水地塞米松濃度測定

1.2.4.1房水采集注射開始后0.5、2、4、8、12、24h，每個亞組分別隨機選取4只大鼠并取雙眼房水樣本。取樣時，予10%水合氯醛無菌溶液(0.3mL/100g)腹腔注射進行麻醉，0.9%生理鹽水沖洗雙眼，清潔無菌紗布吸干，顯微注射器刺入前房抽取房水25μL。所有樣本置于-20℃冰箱中冷凍保存，待測。

1.2.4.2樣本處理精密吸取15μL房水于1.5mL離心管中，加入5μL潑尼松溶液(內標物，1600ng/mL)、5μL地塞米松磷酸鈉和60μL乙腈，渦旋7min，于5000r/min離心10min，精密量取上清液20μL注入高效液相色譜儀分析，記錄峰面積，計算房水中地塞米松濃度。

1.2.4.3質譜條件離子化方式：電噴霧離子化(ESI)；掃描方式：選擇性負離子監測(SIM)；加熱塊溫度(block)：200℃；曲型脫溶劑裝置溫度(CDL)：250℃；CDL電壓：250V；檢測電壓：1.85kV；霧化氣流速：1.5L/min；干燥氣流速：2.0L/min；質荷比：[M-H]-地塞米松磷酸鈉m/z=471，內標潑尼松m/z=455，見圖1。

1.2.4.4標準曲線繪制取地塞米松磷酸鈉標準品制備濃度為100、200、400、800、1600、3200、6400ng/mL標準工作液，取15μL空白房水(正常大鼠房水)于1.5mL的離心管中，精密加入5μL潑尼松溶液(內標物，1600ng/mL)、5μL標準工作液和60μL乙腈，配制成質量濃度為25、50、100、200、400、800、1600ng/mL的標準含地塞米松房水樣品，根據1.2.4.3進行操作，制備標準曲線。每個濃度重復5次。分別以空白房水中地塞米松磷酸鈉的質量濃度為橫坐標，以地塞米松磷酸鈉與內標的峰面積比為縱坐標，進行線性回歸，得標準曲線方程為：Y=0.0009728X+0.0021639，R2=0.9995715，R=0.9997857。地塞米松在25.0～1600.0μg/mL時線性關系良好。

表1 注藥前后各組T2DM大鼠血糖濃度

注：aP<0.05vs同組0h；cP<0.05vs同組2h；eP<0.05vs同組4h；gP<0.05vs同組8h；iP<0.05vs同組12h。

圖2不同途徑注藥對T2DM大鼠血糖濃度的影響A：不同途徑注射地塞米磷酸鈉對T2DM大鼠血糖的影響；B：不同途徑注射生理鹽水對T2DM大鼠血糖的影響。

1.2.4.5系統適用性試驗(1)精密度試驗：取地塞米松磷酸鈉標準品制備質量濃度為1000、2000、4000、6000ng/mL的標準工作液，根據1.2.4.2樣本處理方法進行樣本處理，根據1.2.4.3進樣分析，每個濃度重復5次，計算日內精密度。樣品置于-20℃冰箱中保存連續5d進樣，每個濃度重復3次，計算日間精密度。日內精密度、日間精密度均小于5%，符合實驗要求。(2)回收率試驗：取地塞米松磷酸鈉標準品制備質量濃度為1000、2000、4000、6000ng/mL的標準工作液。根據1.2.4.2樣本處理方法進行樣本處理，根據1.2.4.3進樣分析，每個濃度重復5次，根據標準曲線回歸方程計算樣品檢出量，方法回收率=樣品檢出量/樣品加入量。方法回收率均大于90%，相對標準偏差(relative standard deviation，RSD)均小于5%，符合實驗要求。(3)穩定性試驗：取地塞米松磷酸鈉標準品，分別于0、1、2、4、6、8、12、16、20、24h時進樣20μL，測定地塞米松峰面積，計算RSD。RSD<2%(n=10)，表明供試品溶液在24h內穩定性良好。(4)重復性試驗：平行精密吸取5份地塞米松磷酸鈉標準品，每份5.0mL，置于10mL容量瓶中，根據1.2.4.2樣本處理方法進行樣本處理，根據1.2.4.3進樣分析，測定地塞米松峰面積值，計算RSD。RSD<2%(n=5)，表明方法重復性良好。

1.2.4.6房水地塞米松濃度測定取待測各組T2DM大鼠雙眼房水樣品，根據1.2.4.2樣本處理方法進行樣本處理，根據1.2.4.3進樣分析，記錄峰面積，根據標準曲線計算房水中地塞米松濃度。

2結果

2.1不同途徑注藥對T2DM大鼠血糖濃度的影響不同途徑注射地塞米松磷酸鈉前后，各組大鼠血糖濃度時間差異有統計學意義(F時間=386.419，P時間<0.001)，但組間差異無統計學意義(F組間=0.151，P組間=0.861)，時間和組間交互作用差異亦無統計學意義(F時間×組間=1.286，P時間×組間=0.276)。三種途徑注藥后2、4、8、24h大鼠血糖濃度與其注藥前(0h)比較，差異均有統計學意義(P<0.05)，見表1，圖2A。

不同途徑注射生理鹽水前后，各組大鼠血糖濃度時間差異有統計學意義(F時間=394.157，P時間<0.001)，組間差異無統計學意義(F組間=0.12，P組間=0.888)，時間和組間交互作用差異亦無統計學意義(F時間×組間=2.311，P時間×組間=0.057)。球旁注射組T2DM大鼠注藥后2、4、8、12、24h，球后注射組和結膜下注射組大鼠注藥后2、4、12、24h血糖濃度與其注藥前(0h)比較，差異均有統計學意義(P<0.05)，見表1，圖2B。

注藥途徑組別0.5h2h4h8h12h24h球旁注射實驗組108.88±4.18189.63±4.25732.38±4.56109.39±4.9346.88±2.2632.76±2.19對照組31.88±2.3238.08±2.0943.80±1.7340.66±1.6939.64±2.0031.03±1.96 t32.20564.043282.39826.3764.7941.18P<0.001<0.001<0.001<0.0010.0030.283球后注射實驗組114.63±5.30183.22±0.79859.60±3.56112.72±5.8936.18±1.9137.63±2.14對照組32.83±0.9740.29±1.3641.29±2.0540.50±1.5041.30±2.4035.45±3.84 t30.357181.92398.3123.78-3.3380.988P<0.001<0.001<0.001<0.0010.0160.371結膜下注射實驗組143.45±0.94957.34±3.60435.75±2.01143.98±7.8164.03±1.7334.31±2.11對照組34.15±2.2539.50±0.9743.16±2.1443.03±2.3042.13±3.9730.01±1.66 t89.661492.566267.52124.80310.1243.206P<0.001<0.001<0.001<0.001<0.0010.018

組別0.5h2h4h8h12h24h球旁注射組108.88±4.18a189.63±4.25a732.38±4.56a,c109.39±4.93a46.88±2.26a,c32.76±2.19c球后注射組114.63±5.30a183.22±0.79a859.60±3.56112.72±5.89a36.18±1.91a37.63±2.14結膜下注射組143.45±0.94957.34±3.60435.75±2.01c143.98±7.8164.03±1.7334.31±2.11 F88.56175248.76215127.27636.454201.0655.361P<0.001<0.001<0.001<0.001<0.0010.029

注：aP<0.05vs同時間結膜下注射組；cP<0.05vs同時間球后注射組。

2.2不同途徑注藥對T2DM大鼠雙眼房水地塞米松濃度的影響球旁注射地塞米松磷酸鈉/生理鹽水后4h，實驗組大鼠雙眼房水地塞米松濃度達到峰值(732.38±4.56ng/mL)，注射后0.5～12h，兩組大鼠雙眼房水地塞米松濃度差異均有統計學意義(P<0.05)；球后注射地塞米松磷酸鈉/生理鹽水后4h，實驗組大鼠雙眼房水地塞米松濃度達到峰值(859.60±3.56ng/mL)，注射后0.5～12h，兩組大鼠雙眼房水地塞米松藥物濃度差異均有統計學意義(P<0.05)；結膜下注射地塞米松磷酸鈉/生理鹽水后2h，實驗組大鼠雙眼房水地塞米松濃度達到峰值(957.34±3.60ng/mL)，注射后0.5～24h，兩組大鼠雙眼房水地塞米松藥物濃度差異均有統計學意義(P<0.05)，見表2。

注射地塞米松磷酸鈉后0.5～24h，球旁注射組、球后注射組、結膜下注射組大鼠雙眼房水地塞米松濃度差異均有統計學意義(P<0.05)，見表3。注射后0.5、2、8h，球旁注射組和球后注射組大鼠雙眼房水地塞米松濃度均低于結膜下注射組，差異均有統計學意義(P<0.05)。注射后4h，球旁注射組和結膜下注射組大鼠雙眼房水地塞米松濃度均低于球后注射組，且結膜下注射組低于球旁注射組，差異均有統計學意義(P<0.05)。注射后12h，球旁注射組和球后注射組大鼠雙眼房水地塞米松濃度均低于結膜下注射組，且球后注射組低于球旁注射組，差異均有統計學意義(P<0.05)。注射后24h，球旁注射組大鼠雙眼房水地塞米松濃度低于球后注射組，差異有統計學意義(P<0.05)。

3討論

本研究發現，三種不同途徑注射地塞米松磷酸鈉或生理鹽水后2h時，大鼠血糖濃度均有一過性升高，分析認為，當機體處于應激狀態時，下丘腦-垂體-腎上腺軸和交感神經腎上腺系統激活，機體釋放兒茶酚胺、皮質醇、生長激素、胰高糖素等分解代謝激素，這些激素直接刺激糖原分解、糖原異生，升高血中葡萄糖[12]。由于STZ的作用，大鼠胰島B細胞壞死[13]，導致胰島B細胞功能缺陷，無法對血糖進行有效調控，導致血糖升高[14]。Zhang等[15]研究發現，玻璃體視網膜手術后T2DM患者眼周注射地塞米松后血糖升高，汪彬等[16]研究發現1型糖尿病大鼠眼局部注射地塞米松后大鼠血糖升高。此外，有研究表明，水合氯醛可提高實驗動物的血糖水平[17]。由此可知，T2DM大鼠血糖升高可能是多因素共同協作的結果。本研究發現，注射地塞米松磷酸鈉后大鼠血糖升高水平略高于注射生理鹽水。Kymionis等[18]評估眼局部使用地塞米松對糖尿病患者血糖水平的影響，結果顯示地塞米松組糖尿病患者血糖水平顯著升高(P=0.003)，而對照組(平衡鹽溶液)未發現任何統計學差異，說明眼局部使用地塞米松提高了控制性糖尿病患者的血糖水平。

本研究結果表明，眼局部三種途徑給藥后，結膜下注射較球旁和球后注射后房水地塞米松濃度先達到峰值。Kim等[19]發現皺襞部、扁平部是鞏膜最具滲透性的區域，藥物經鞏膜到達眼前段，且藥物在鞏膜的滲透性并不依賴于其親脂性[20]，本實驗采用的注射用地塞米松磷酸鈉為水溶性，易于鞏膜吸收。因結膜下注射比球旁、球后注射后藥物能更接近鞏膜，故結膜下注射比球旁、球后注射經鞏膜擴散量更大。此外，我們觀察到大鼠眼局部結膜下注射地塞米松磷酸鈉后，部分液體從針孔處溢出，溢出的藥物可通過角膜途徑吸收。Urtti等[21]研究發現，局部應用滴眼液后前房房水中的藥物峰值濃度可在20～30min后出現；Ghate等[22]研究發現，結膜下注射NaF 2h時可在視網膜上觀察到濃度峰值；Weijtens等[23]評估結膜下注射地塞米松患者房水、玻璃體和血清中的地塞米松濃度，并與球周注射比較，分析結膜下注射作為將地塞米松輸送到玻璃體內的有效性，結果發現注射后2.5h，房水中估計的最大地塞米松濃度為858ng/mL，達到藥物濃度峰值，結膜下注射2.5mg地塞米松后玻璃體地塞米松峰值濃度比球周注射5mg地塞米松后高出3倍，該研究還發現地塞米松從房水擴散到玻璃體腔可能是地塞米松進入玻璃體腔的第三種方式。這與本研究觀察到結膜下注射途徑先出現藥物濃度峰值是一致的。

此外，我們發現，眼局部三種途徑給藥后，藥物濃度峰值結膜下注射(957.34±3.60ng/mL)>球后注射(859.60±3.56ng/mL)>球旁注射(732.38±4.56ng/mL)。Cheruvu等[24]研究發現，脂族化合物如地塞米松在Bruch膜和脈絡膜內顯著滯留，可能是由于黑色素水平較高。視網膜色素上皮(RPE)和脈絡膜都含有豐富的黑色素，球旁和球后注射藥物經鞏膜滲透進入玻璃體內，從而彌散至前房，藥物濃度峰值出現在結膜下途徑之后。Weijtens等[25]評估球周注射、結膜下注射地塞米松后視網膜下液中地塞米松濃度，研究發現球周注射、結膜下注射視網膜下液中最大地塞米松濃度分別為82.2、359ng/mL。提示與球周注射相比，結膜下注射地塞米松能更有效地將藥物遞送到視網膜下液中。說明經結膜下途徑到達眼內的藥物濃度高于眼周途徑，這與本研究結果一致。另有研究認為，球周注射為有創給藥方式，長期給藥易造成局部異物反應，引起結膜粘連，給患者帶來主觀不適[26]，球旁、球后注射可能導致眼瞼皮下出血、結膜水腫、球后出血、上瞼下垂、刺破眼球等并發癥[27]。我們在解剖取樣時也發現部分大鼠出現眼球球壁局部血腫、球后血腫現象，但具體機制尚待進一步研究。

綜上所訴，三種途徑注射地塞米松對T2DM大鼠血糖的影響無明顯差異，而結膜下注射地塞米松操作簡單，可在短時間內達到較高的藥物濃度，是一種較為方便的地塞米松給藥方式。隨著對鞏膜、脈絡膜、RPE層藥物動力學認知的不斷提升以及材料工程學、藥物試劑的發展，眼部給藥方式和新型材料得到了深入研究，期待給患者帶來新的治療希望。