TERT基因單核苷酸多態性與年齡相關性黃斑變性的關聯研究

李寶華，劉 平，王 新

0引言

年齡相關性黃斑變性(ARMD)是嚴重威脅老年人身體健康的一種重要疾病。隨著年齡的增加，視網膜色素上皮細胞和神經視網膜發生退行性病變，造成不可逆性視力下降或喪失。ARMD在西方國家已成為第一位致盲性眼病，在亞洲其發病率亦逐漸增多[1]。因其病因不明，目前仍未找到阻止其病程進展的有效方法，因此臨床中加強該病的診斷與治療對于降低其發病率，提高預后效果具有重要的研究意義。

端粒是位于真核生物染色體末端的核蛋白復合體，其主要作用是保證染色體完整和基因組穩定性。端粒長度進行性縮短最終可導致細胞分裂停止，迫使細胞衰老及死亡[2]。已有研究發現端粒長度與ARMD發病之間存在一定關聯[3]。端粒酶的活化是端粒長度維持或延長的主要機制，端粒酶逆轉錄酶(TERT)是端粒酶催化亞基，可通過合成染色體末端DNA而延長端粒，致使細胞異常增殖甚至永生化[4]。單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism，SNP)是基因組中重要的遺傳變異之一，已有研究發現TERT基因遺傳變異與冠心病、肺癌、腎癌等多種重大疾病發生密切相關[5-7]，而目前TERT基因SNP與ARMD發病風險的關聯仍未見報道。基于此，本文通過高通量遺傳變異基因分型技術，探討TERT基因SNP與ARMD患者發病風險的相關性，評估其作為ARMD患者早期診斷新型分子標志物的可行性。

1對象和方法

1.1對象選取2017-03/2019-01于我院眼科就診并確診為ARMD的患者191例為病例組，其中男101例，女90例；年齡68.0±4.6歲。納入標準：(1)經眼底血管熒光造影及OCT檢查確診為ARMD；(2)年齡不小于45歲；(3)均為漢族。排除患有除ARMD以外的其它眼部疾病，既往有眼外傷史、眼部手術史，合并高血壓、心血管疾病、糖尿病、腫瘤等全身性疾病患者。選取同期來我院體檢的健康體檢者197例為對照組，其中男109例，女88例；年齡67.1±6.0歲。兩組受檢者性別構成、年齡相匹配，差異無統計學意義(χ2=0.235，P=0.628；t=1.618，P=0.107)。本研究經過本院倫理委員會審查通過，所有受檢者均同意參加本研究并簽署知情同意書。

表1 TERT基因SNP等位基因基因型與ARMD發病風險的關聯

SNP編號基因區域等位基因型MAF病例組對照組PaOR(95%CI)Pbrs2075786內含子A/G0.1650.1600.9991.03(0.85～1.25)0.767rs10069690內含子C/T0.1990.1400.7891.24(1.02～1.50)0.029rs2242652內含子G/A0.2040.1750.1491.10(0.92～1.31)0.319rs2853677內含子A/G0.3720.3650.9781.01(0.87～1.17)0.873rs2853676內含子C/T0.1780.1550.9261.08(0.90～1.31)0.415rs2736098外顯子C/T0.3870.3810.7431.01(0.87～1.17)0.892rs2736122內含子G/A0.0810.0760.6861.04(0.80～1.35)0.774

注：a：Hardy-Weinberg平衡分析P值；b：非條件性Logistic回歸計算P值，并通過年齡和性別校正。

1.2方法

1.2.1血樣DNA提取采集受檢者空腹靜脈血4mL，分離血漿后，進行血細胞DNA提取(全血基因組小量抽提試劑盒，北京百泰克生物技術有限公司)，操作步驟按照試劑盒說明書進行，定量后標記并置于-80℃冰箱凍存備用。

1.2.2 SNP位點選擇和基因分型通過PubMed數據庫篩選目前已報道的TERT基因中與端粒長度相關的SNP位點作為候選SNP位點[6，8-9]，并且在中國漢族人群中次等位基因型頻率>0.05，候選位點中連鎖不平衡相關程度>0.8的位點只保留1個，最終選擇7個位點(rs2075786、rs10069690、rs2242652、rs2853677、rs2853676、rs2736098、rs2736122)進行基因分型。基因分型實驗采用Sequenom Mass Array高通量技術平臺(Sequenom Inc.，San Diego，CA，USA)完成。

2結果

2.1 TERT基因SNP不同等位基因型與ARMD發病風險的關聯對照組受檢者7個SNP位點基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05，表1)。分析每個位點不同等位基因型人群的ARMD發病風險發現，rs10069690等位基因型為T型的人群與C型相比發病風險顯著提高[OR(95%CI)=1.24(1.02～1.50)，P=0.029]，其它位點不同等位基因型與ARMD發病風險無顯著相關性。

表2 TERT基因SNP不同基因型的人群分布 例

2.2 TERT基因SNP不同基因型的人群分布進一步分析每個SNP位點3種基因型在兩組受檢者中的分布發現，SNP位點rs10069690突變基因型(CT、TT)在病例組的比例顯著高于對照組(P=0.03，表2)，其它位點3種基因型的人群分布在兩組間無顯著差異。

2.3 TERT基因SNP位點rs10069690基因型與ARMD發病風險的關聯利用最常用的3種遺傳模型進一步對SNP位點rs10069690不同基因型與ARMD發病風險的關聯進行分析發現，顯性模型得到結果最為顯著，即與rs10069690野生型(CC)人群相比，包含突變型(CT+TT)的人群ARMD發病風險提高了63%[OR(95%CI)=1.63(1.05～2.53)，P=0.03]，通過隱性模型分析，純合突變型人群(TT)與野生型及雜合型人群相比，ARMD發病風險無顯著差異，見表3。

3討論

本研究通過已發表文獻篩選出TERT基因中7個與端粒長度存在關聯的SNP位點，利用基因分型技術和統計學分析首次發現SNP位點rs10069690不同基因型與ARMD發病風險存在顯著關聯，包含突變基因型的人群發病風險顯著提高，其它位點在本研究中未觀察到與ARMD發病風險相關的證據。

表3 TERT基因SNP位點rs10069690基因型與ARMD發病風險的關聯 例

注：a：非條件性Logistic回歸計算P值，并通過年齡和性別校正。

TERT基因位于人類染色體5p15.33，作為端粒酶的核心組成部分，是調節端粒酶活性的關鍵[10]。已有大量研究發現TERT基因SNP與多種疾病發生及進展密切相關，尤其在腫瘤研究領域，多項研究發現TERT基因SNP與腫瘤密切關系，然而與ARMD的相關性仍未見報道。Duan等[11]通過病例對照研究發現TERT基因SNP位點rs2853676與胃癌發病風險升高有關。另有研究發現，SNP位點rs2853677與非小細胞肺癌及肺腺癌易感性密切相關[6，12]。而在本研究中，rs2853676和rs2853677與ARMD發病風險無顯著相關性。SNP位點rs2736098位于TERT基因第二外顯子上，國內外多項研究表明rs2736098多態性與膀胱癌易感性相關。Rafnar等[13]通過全基因組關聯研究發現rs2736098與歐洲人群膀胱癌易感性密切相關。另一項研究發現，TERT基因rs2736098位點多態性與美國洛杉磯人群膀胱癌易感性無關，而與中國上海人群膀胱癌易感性相關[14]。本研究中rs2736098多態性與ARMD發病無顯著關聯。也有研究發現rs2242652與黑色素瘤發病風險密切相關[15]。

SNP位點rs10069690位于TERT基因第四內含子，目前已發現rs10069690基因型與乳腺癌、膠質瘤、卵巢癌等多種腫瘤發病或預后密切相關[16-19]，提示該位點在疾病發生及進展中可能發揮一定作用。本研究首次證實了rs10069690與ARMD發病風險密切相關，但其具體機制仍需進一步研究。我們推測SNP位點rs10069690不同基因型可能通過影響TERT基因表達活性，從而改變端粒長度促進ARMD發生。雖然rs10069690位點位于基因內含子區，但極有可能通過強連鎖的SNP位點發揮基因表達調控作用，因此rs10069690不同基因型影響ARMD發生的功能機制有待進一步開展。

ARMD是一種衰老相關疾病，目前對ARMD的治療主要是阻止早期ARMD向晚期ARMD的發展，而對于晚期ARMD的治療手段有限，因此識別ARMD的危險因素對于ARMD的早期預防及延緩進展具有重要意義，找到可以用于ARMD臨床診斷的遺傳變異標志物仍需篩選新的位點以及大樣本量研究驗證。