翼狀胬肉患者眼表微生物菌群分析

惠 娜，秦 莉，黎 黎

0引言

翼狀胬肉是一種眼部常見的慢性炎癥性增殖性疾病，瞼裂部異常增生肥厚的球結膜及其下纖維組織跨越角膜緣長入角膜形成其典型翼狀形態[1]。近年來，對翼狀胬肉發病機制進行了大量研究和探索，例如角膜緣干細胞屏障受損失去屏障作用、紫外線照射、病毒感染、遺傳因素或基因突變、細胞因子、生長因子、金屬蛋白酶增加、地理環境等因素均有影響[2-4]，以及對于翼狀胬肉致病基因的鑒定研究[5]，但尚無定論。有研究表明，免疫介導的炎癥反應在翼狀胬肉的發生發展中起著重要作用。而眼表微生物菌群與外部環境交互作用，參與機體防御等免疫反應環節，維持眼表微生物的穩定對于眼部意義重大。目前微生物組的研究多集中于腸道、口腔[6-7]，而眼表微生物菌群組成的變化是否與翼狀胬肉相關尚不清楚，未來對翼狀胬肉治療的研究方向可能集中在基因遺傳途徑上[8]。因此，本研究通過16S rDNA基因測序翼狀胬肉眼及對側正常眼眼表微生物菌群的多樣性、相對豐度等進行比較，從而探討翼狀胬肉患者眼表微生物組成的改變，為下一步研究翼狀胬肉的發病機制奠定基礎，為翼狀胬肉的預防和治療提供新的思路。

1對象和方法

1.1對象研究對象為2018-09/2019-01在我院就診的50例翼狀胬肉患者，最終根據獲取DNA濃度，納入翼狀胬肉組(A組)為26例26眼，對照組(B組)為胬肉患者的對側正常眼9例9眼。兩組年齡、性別比較，差異無統計學意義(P>0.05)。納入標準：單眼發病；原發性翼狀胬肉。排除標準：有其它眼部疾病、過敏性疾病及全身性疾病，近期配戴過角膜接觸鏡，近期做過眼表理療及眼部手術，近期使用過激素類藥物。根據實驗需求，通過本院倫理委員會認證，征得患者同意并簽字，擬行嚴格無菌眼表取材。

1.2方法

1.2.1樣品采集與保存受試者雙眼滴鹽酸丙美卡因滴眼液，1～3min后囑受試者雙眼向上看，使用無菌干棉拭子，輕微壓力涂擦受試者眼球下方的球結膜表面。囑受試者勿眨眼，勿碰觸眼部皮膚等其他部位，嚴格無菌操作。采用同樣的方法對受試者對側正常眼進行樣本采集。結膜樣本拭子，保存于1.5mL無菌管中放入冰盒送入實驗室，-80℃冰箱凍存，1wk內提取(16Sr)DNA。

1.2.2 DNA提取與PCR擴增樣本被接收后,將棉拭子前端無菌處理剪下，轉移至離心管中，裂解，冷卻，加入1mL酚/氯仿/異戊醇離心12000r/min，10min,25℃。取上清，加入-20℃預冷的異丙醇，10% 3mL醋酸鈉，-20℃過夜沉淀。重復離心3次，晾干后溶于適量緩沖液，提取完成，使用10g/L瓊脂糖凝膠檢測DNA提取質量。用V3-341F(5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’)和V4-806R(5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’)通用區引物對16SV3～V4可變區進行PCR擴增。取30ng DNA樣品及融合引物配置PCR反應體系。以基因組DNA為模板，進行融合引物PCR，使用Agencourt AMPure XP磁珠進行純化并溶于Elution Buffer，建庫完成。使用Agilent 2100 Bioanalyzer軟件檢測文庫的片段范圍及濃度。檢測合格的文庫進行測序。

1.2.3測序及數據處理

1.2.3.1高通量測序使用IIIumina的Miseq PE301+8+8+301平臺進行雙端測序。

1.2.3.2數據處理下機數據經過數據過濾，濾除低質量的reads，剩余的Clean data用于后期分析；將reads拼接成Tags；將Tags聚成OTU，對OTU進行物種注釋；基于OTU和物種注釋結果進行樣品物種復雜度分析以及組間物種差異分析。群落結構層面：多樣本物種分布比較，群落相似度比較，群落相似度PCoA分析，組間進化的差異顯著性(Un)Weighted Unifrac分析，分析因子之間的關系，構建系統發育樹。

圖1維恩圖。

圖2基于豐度的PLS-DA分析。

統計學分析：采用Lefse軟件進行統計學分析，找出各組間差異的微生物種類，兩樣本間的差異分析及多樣性比較采用R軟件的秩和檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1 OTU聚類分析在97%相似性下對序列進行OTU聚類分析，共得到1837個OTUs，翼狀胬肉組共含有1381個OTUs，對照組共得到1207個OTUs，兩組共有的OTU個數為751個(圖1)。各組樣品豐富度和均勻度良好,而翼狀胬肉組比對照組擁有較多的特有OTU個數。

2.2基于OTU豐度的PLS-DA分析PLS-DA分析是一種將主成分分析和多元回歸的功能相結合，達到循環PCA的各個成分以使其之間的間隔達到最大化，從而加大各組觀察結果之間的間隔的目的。本研究的PLS-DA分析顯示翼狀胬肉組與對照組分成了兩個群落，顯示了兩組OTU豐度上有差異(圖2)。

2.3物種注釋分析兩組樣本共鑒定出了172種細菌，這些細菌分為34個門369屬。兩組眼表微生物菌群結構在門水平上的比較：兩組樣本的前四位優勢菌門相同，豐度由高至低依次為：放線菌門、厚壁菌門、變形菌門、擬桿菌門。四種優勢菌門共占翼狀胬肉組的97%，占對照組中的92%。在翼狀胬肉組，放線菌門豐度明顯高于正常對照組，但差異無統計學意義(P=0.87，圖3)。

在屬水平，翼狀胬肉組共發現337個菌屬，明顯高于對照組的275個菌屬。同樣兩組前三位優勢菌屬相同，豐度由高至低依次為：棒狀桿菌屬、未分類菌屬、葡萄球菌屬，共占翼狀胬肉組的53%，占對照組的49%。在翼狀胬肉組，棒狀桿菌的豐度明顯高于對照組，但差異無統計學意義(P=0.57，圖4)。

在種水平，未分類菌種、葡萄球菌種及鏈球菌種為兩組樣本的共同優勢菌種，其中，未分類菌種在兩組中豐度均最高，且在兩組中比例基本相同。值得關注的是，棒狀桿菌在翼狀胬肉組的豐度仍明顯高于對照組，表皮葡萄球菌種、放線菌種及副球菌種在翼狀胬肉組豐度明顯低于正常對照組(圖5)。

圖3樣品門分類水平中物種柱狀圖。

圖4樣品屬分類水平中物種柱狀圖。

圖5樣品種分類水平中物種柱狀圖。

2.4 Alpha多樣性分析通過單樣品的多樣性分析(Alpha多樣性)可以反映微生物群落的豐度和多樣性。根據obseerved species指數、chao指數、ace指數分析，對照組的多樣性高于翼狀胬肉組，差異有統計學意義(P<0.01，圖6)。兩組物種多樣性存在差異，有統計學意義(P<0.05，圖6)。本次樣品文庫的平均覆蓋率(coverage指數)為99.93%,稀釋曲線平緩已達到平臺期，反映測序深度已經基本覆蓋到樣品的所有物種，能代表樣品的真實情況(圖7)。

2.5樣品組間菌群構成差異分析我們通過對兩組樣本進行lefse分析顯示，兩組樣品共有15種差異菌被發現，它們分別屬于不同分類水平的菌，在翼狀胬肉組特有的物種為：紫單胞菌科、圖利茨菌目；對照組特有的物種為：紅細菌目、副球菌屬、奈瑟球菌屬、乏養菌屬、卟啉單胞菌屬、反硝化細菌熱胞菌屬、黃單胞菌屬、郝檸檬氏菌屬、勞特羅普氏菌屬。這些差異物種在兩組的相對豐度及數量均較低(圖8)。

3討論

微生物的多樣性及結構研究是進行復雜微生態系分析的基礎,通過研究翼狀胬肉患者眼表及正常眼表微生物菌群的豐度與結構,能夠揭示翼狀胬肉眼表與正常眼表微生物群落之間的關系,從而為預防和治療翼狀胬肉提供合理的理論依據[9]。

近年來，國內外學者關注到在機體定植的微生物菌群，已參與到宿主的防御、免疫等多個環節，微生物菌群與機體的交互作用，對機體疾病的發生發展有深遠影響。例如腸道菌群與糖尿病、肥胖、潰瘍性結腸炎、結直腸癌、甲狀腺功能亢進，甚至焦慮、抑郁癥，都有較強關聯[6，10]。但眼表微生物菌群以及其與眼部疾病的關系研究報道甚少。以往傳統微生物細菌培養法顯示：構成人眼表的微生物群落以革蘭氏陽性菌為主，其中主要以葡萄球菌屬為主，其次是類白喉菌(包括棒狀桿菌)、鏈球菌、丙酸桿菌、微球菌等，其他還偶見芽孢桿菌、假單胞菌、嗜麥芽窄食單胞菌、大腸埃希菌、產堿桿菌、不動桿菌、奈瑟菌和莫拉菌等[11-12]，國外研究還分離出少量的考克菌、羅氏菌、氣球菌、腸球菌、流感嗜血桿菌等[13-15]。但傳統微生物檢測，大多情況是純培養，不可避免地會造成菌株的富集或衰減，人為地改變了原始菌群的構成，對研究結果造成了較大的偏差[16]。并且對于復雜環境的局限性，許多微生物無法培養得到，因此嚴重低估了微生物多樣性對宿主的影響。而且，僅從形態特征，理化特征、菌體某些化學成分，還不足以鑒定微生物，以及深刻認識其親緣關系，也不能解釋臨床現象，故需要從基因水平全面識別微生物的特點。16S rRNA/DNA序列分析的優勢在于：可檢測出罕見的細菌；可作為分枝桿菌的常規檢測手段；幫助人們發現新的菌種；檢測無法分離培養的細菌等。16S rRNA/DNA序列分析已經被應用于分析腸道[17]、口腔[18-19]、呼吸道[20]等多部位，針對眼部的研究相對較少，目前仍未得出公認的眼表微生物菌群結果[21]，但根據針對結膜炎[22-24]、角膜炎[25]、干眼[26]等研究，均認為該方法是分析眼部樣品科學可靠的方法。近年來，越來越多的微生物的16S rDNA序列被測定并收入國際基因數據庫中，用16S rDNA作目的序列進行微生物菌群結構分析更為快捷方便。

圖6組間Alpha多樣性盒形圖A：obseerved species指數；B：chao指數；C：ace指數；D：shannon指數；E：simpson指數；F：Good’s coverage。

圖7物種多樣性Alpha指數稀釋曲線圖。

圖8LDA SCORE。

本研究基于16S rDNA的PCR產物的基因鑒定法在兩組樣本中共發現了172種細菌，顯示眼表的細菌多樣性明顯高于其他技術[9，22]，在屬水平，豐度最高的是棒狀桿菌，此結果與我們其它實驗組的結果一致，說明了研究結果的可靠性。兩組均以革蘭氏陽性菌為主，這與傳統的微生物細菌培養的檢測結果相一致。本研究與美國BASCOM PALMER眼科研究所運用二代測序技術基于16S rDNA PCR鑒定法對部分健康人群的眼表菌群的研究結果基本相似[22，27-28]，進一步印證了眼表菌群主要由以凝固酶陰性葡萄球菌、棒狀桿菌、鏈球菌、丙酸桿菌等革蘭氏陽性菌為主的多種菌共同組成。同時，無法分類菌種在種水平上兩組中均占比例較高，說明新技術一方面證實了部分經典培養法對眼部菌群研究的結論，另一方面對菌群分析得更加細致和準確的同時也產生了新的問題。

根據多樣性研究結果顯示翼狀胬肉組眼表微生物菌群Alpha多樣性較正常對照組減少(P<0.01)。但考慮相對豐度及物種均勻度的影響后的shannon指數并未發現顯著性差異。Beta多樣性顯示兩組菌群構成區分不明顯。說明兩組的菌群組成相似度高，但翼狀胬肉組的微生物菌群物種的豐富度較正常對照組減少，有顯著差異性。在健康人體中，微生物群、宿主和外環境所構成的生態系統在正常情況下是相互平衡的，平衡遭到破壞而引起疾病稱為微生態失衡[7]。而多樣性的減少可能導致眼表微生物菌群的微生態失衡，影響到機體的免疫調節及眼表微生物菌群的穩態。這是否與翼狀胬肉的發生有一定的相關性是值得研究的問題。

另外，值得關注的是，兩組樣品在屬水平及種水平上，棒狀桿菌的豐度在翼狀胬肉組均明顯高于對照組。棒狀桿菌屬革蘭氏陽性桿菌。除白喉棒狀桿菌外，其他棒狀桿菌為人類口腔、鼻腔、咽喉部、外耳道、眼結膜、外陰和皮膚等處的寄生菌，這類細菌一般無致病性，因此在臨床上棒狀桿菌一般被視為正常菌群[27，29]。但近年研究表明，該菌屬的多數菌種均可作為條件致病菌引起抵抗力低下的宿主發生各類感染[30]。由于以往檢測條件的限制，棒狀桿菌的檢出率遠較實際低。而本研究結果中棒狀桿菌檢出的比例增加提示可能會增大了條件致病的可能性。

綜上所述，我們的研究結果顯示了翼狀胬肉組較對照組在眼表微生物菌群的數量和多樣性方面有差異。其中，引起我們關注的是棒狀桿菌的比例在翼狀胬肉組明顯增高，而這種結果是否會引起進一步的免疫反應，并與翼狀胬肉的發生發展有關，這是我們進一步研究的方向。