EphA1/EphrinA反饋環(huán)調(diào)控內(nèi)皮祖細胞促肝細胞癌血管生成潛能

俞海濤，郭鵬毅，謝孝宰，陳鋼

（1.嘉興學院附屬第二醫(yī)院 肝膽外科，浙江 嘉興 314000；2.寧波市鄞州區(qū)第二醫(yī)院 心胸外科，浙江寧波 315000；3.溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院 肝膽外科，浙江 溫州 325015）

內(nèi)皮祖細胞能特異性地靶向腫瘤新生血管并參與血管生成，因此以內(nèi)皮祖細胞為載體和靶點的抗血管生成治療有著誘人的應(yīng)用前景，然而由于內(nèi)皮祖細胞中治療基因表達的不受調(diào)控會導(dǎo)致治療失敗，因此能否精確調(diào)控治療基因定時、定量表達是取得突破的關(guān)鍵。前期實驗將Tet-on基因表達系統(tǒng)調(diào)節(jié)質(zhì)粒及EphA1小干擾RNA質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染進大鼠骨髓起源內(nèi)皮祖細胞系中并構(gòu)建了可精確調(diào)控EphA1基因表達的雙穩(wěn)轉(zhuǎn)內(nèi)皮祖細胞系EPCsEphA1/SiRNA-Tet，并證實利用強力霉素可精確誘導(dǎo)內(nèi)皮祖細胞中EphA1 SiRNA質(zhì)粒表達，從而導(dǎo)致EphA1 mRNA和蛋白表達的下調(diào)[1]。本研究進一步分析體外調(diào)控EPCsEphA1/SiRNA-Tet中EphA1基因的表達對EphA1/EphrinA1 信號通路以及對其細胞生物學行為的影響；同時探討體外誘導(dǎo)活體內(nèi)EPCsEphA1/SiRNA-Tet中EphA1基因表達對其促肝癌血管生成的影響，旨在通過本研究建立一種安全、高效的可以調(diào)控基因表達的內(nèi)皮祖細胞為載體和靶點的肝癌抗血管生成治療模式。

1 材料和方法

1.1 細胞系與裸鼠 6～8 周齡雄性BALB/c裸鼠購自上海實驗研究動物中心，飼養(yǎng)于溫州醫(yī)科大學實驗動物中心，實驗動物許可證號為SYXK（浙）2015-0009。huh7 肝癌細胞株（本實驗室保存），內(nèi)皮祖細胞系本實驗室構(gòu)建。

1.2 試劑與材料 EphA1、EphrinA1多克隆抗體（美國Santa Cruz公司）、CD31單克隆抗體（英國Abcam公司），MTT（美國Sigma公司），Matrigel膠（美國R&D公司），Transwell小室（美國Corning公司），EGM-2含生長因子培養(yǎng)基（瑞士LONZA公司）；胎牛血清（美國Gibco公司）。

1.3 Western blot檢測強力霉素對EphA1/EphrinA1信號通路影響 檢測強力霉素對EPCsTet-On-EphA1SiRNA中EphA1及其配體EphrinA1蛋白表達的影響：分為調(diào)控組[Dox（+）組，培養(yǎng)液中分別含強力霉素1 μg/mL、10 μg/mL和100 μg/mL]及非調(diào)控組[Dox（-）組]。簡要步驟：收獲對數(shù)生長期的細胞約2×105個，加100 μL細胞裂解液混勻后，于12 000 r/min離心30 min，取上清液作為細胞總蛋白質(zhì)，經(jīng)SDS聚丙烯酰氨凝膠分離蛋白，電轉(zhuǎn)膜法將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。5% BSA加一抗溫育過夜，TBST洗滌，加二抗溫育1 h，后用ECL化學發(fā)光試劑于暗室自顯影。

1.4 MTT比色實驗測內(nèi)皮祖細胞體外增殖能力 取對數(shù)生長期的EPCsEphA1/SiRNA-Tet，5 000個/孔接種于96孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)24 h待細胞貼壁后吸棄培養(yǎng)基（此時培養(yǎng)基中均不含強力霉素），待細胞貼壁后，更換培養(yǎng)基，培養(yǎng)基總體積200 μL，其中Dox（+）組培養(yǎng)液中分別含強力霉素1、10和100 μg/mL。分別在接種后24、48、72 h取細胞進行MTT比色試驗。簡要步驟：每孔加入5 g/L的MTT溶液10 μL，孵育4 h后終止培養(yǎng)，吸棄上清，加入150 μL DMSO，振蕩15 min，用酶聯(lián)免疫檢測分析儀測定490 nm處吸光度值，以只加培養(yǎng)液，不加細胞的空白對照孔調(diào)零，以時間為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制細胞的生長曲線。

1.5 細胞劃痕實驗檢測EPCsTet-On-EphA1SiRNA體外遷移能力 取對數(shù)生長期的EPCsEphA1/SiRNA-Tet，100 000個/孔接種于6 孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)24 h待細胞貼壁后吸棄培養(yǎng)基（此時培養(yǎng)基中均不含強力霉素），細胞貼壁后，更換培養(yǎng)基，培養(yǎng)基總體積500 μL，其中Dox（+）組培養(yǎng)液中分別含強力霉素1、10和100 μg/mL。簡要步驟：待細胞生長滿90%左右后，采用200 μL的槍頭在孔中央作一垂直水平的寬度0.6 mm左右的劃痕，在培養(yǎng)0、12和24 h時于倒置相差顯微鏡下攝片。測量各個時間點的劃痕兩側(cè)細胞間的距離，測量時沿劃痕邊緣等距離間隔作5個標記作為數(shù)據(jù)測定點，取平均值，每組重復(fù)3次。

1.6 Transwell法檢測EPCsTet-On-EphA1SiRNA體外侵襲能力 Transwell實驗中所用的Matrigel膠能在聚碳酸濾膜表面形成類似天然基底膜的結(jié)構(gòu)，細胞侵襲穿過重建Matrigel的能力反映EPCsEphA1/SiRNA-Tet的侵襲能力。Matrigel基質(zhì)膠4 ℃下過夜使其變成液態(tài)，后加入transwell小室的上室中，每室100 μL（冰上操作），37 ℃下放置2～3 h使其凝固。分別用含1、10和100 μg/mL或不含強力霉素的無血清培養(yǎng)基1 mL重懸EPCsEphA1/SiRNA-Tet（1×106個細胞/mL）。每上室分別加200 μL細胞懸液。下室中均加入500 μL含20%胎牛血清的培養(yǎng)基，37 ℃下孵育48 h。取出小室，PBS洗2遍；用棉簽輕輕擦去上室上表面的細胞，0.1%結(jié)晶紫溶液常溫下染色10 min，4%中性甲醛固定、封片，顯微鏡下觀察穿過濾膜的細胞數(shù)。每張膜隨機取5個視野，計數(shù)每個視野內(nèi)的細胞數(shù)取其均值，實驗重復(fù)3次。

1.7 測量裸鼠移植瘤血管生成體積 取5×106個細胞/mL對數(shù)生長期肝癌細胞系Huh-7細胞皮下接種于裸鼠左前肢腋下，成瘤后取生長旺盛期的腫瘤組織剪切成1 mm3左右小塊，無菌條件下皮下接種于20只裸鼠左前肢腋下部位；在皮下接種腫瘤細胞第7天后經(jīng)尾靜脈回輸EPCsEphA1/SiRNA-Tet（1×106/只）。隨后將裸鼠隨機分為4組（每組5只）：Dox（+）組第2周起飼以含強力霉素（10、100和1 μg/mL）的5%蔗糖溶液，Dox（-）組則飼以5%蔗糖溶液，每4 d更換飲用水。Dox（+）組和Dox（-）組裸鼠體質(zhì)量無明顯差異。每周記錄裸鼠移植瘤體積并在培養(yǎng)第7周后處死裸鼠，切取皮下移植瘤進行對比，每只裸鼠皮下移植瘤切取部分，甲醛固定后做石蠟包塊，切片后使用CD31進行免疫組織化學染色，統(tǒng)計裸鼠移植瘤中微血管密度。

1.8 統(tǒng)計學處理方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學處理，計量資料以表示，2組間比較用t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 體外調(diào)控EphA1表達對EPCsEphA1/SiRNA-Tet細胞EphA1/EphrinA1信號通路影響 Dox（+）組中EphA1蛋白表達水平明顯降低，其中10 μg/mL Dox（+）組（0.293±0.029）較Dox（-）組（0.943±0.041）明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（t=12.94，P＜0.001）。EphrinA1是EphA1的特異性配體，Dox（+）組調(diào)控后EphrinA1蛋白表達水平明顯下調(diào)，10 μg/mL Dox（+）組（0.322±0.041）與Dox（-）組（0.892±0.065）比差異有統(tǒng)計學意義（t=4.864，P=0.008），見圖1。

圖1 體外調(diào)控EphA1 表達后EPCsEphA1/SiRNA-Tet細胞EphA1和EphrinA1蛋白表達的Western blot電泳圖

2.2 體外調(diào)控EphA1 基因?qū)PCsEphA1/SiRNA-Tet增殖能力的影響 在24、48 和72 h時對比各組間EPCsEphA1/SiRNA-Tet細胞增殖能力，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見圖2。

2.3 體外調(diào)控EphA1表達對EPCsEphA1/SiRNA-Tet運動能力的影響 劃痕12 h后鏡下可見各組EPCsEphA1/SiRNA-Tet細胞大部分恢復(fù)正常形態(tài)，并且仍保留明顯空白區(qū)。1 μg/mL Dox（+）組、10 μg/mL Dox（+）組、100 μg/mL Dox（+）組及Dox（-）組的細胞劃痕間距比值分別為（39.17±4.03）%、 （37.03±3.58）%、（44.97±3.81）%及（60.87±4.01）%；10 μg/mL Dox（+）組遷移距離較Dox（-）組明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義（t=4.435，P=0.002）；24 h后Dox（-）組劃痕已愈合，而Dox（+）組仍保留明顯空白區(qū)，見圖3。

2.4 體外調(diào)控EphA1表達對EPCsEphA1/SiRNA-Tet細胞侵襲能力的影響 24 h后1 μg/mL Dox（+）組、10 μg/mL Dox（+）組、100 μg/mL Dox（+）組及Dox（-）組穿過濾膜的數(shù)目為（74.6±7.2）個、 （67.8±4.5）個、（84.6±7.8）個及（92.4±8.9）個；與Dox（-）組比10 μg/mL Dox（+）組穿過濾膜的細胞數(shù)明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義（t=2.467，P=0.039）。見圖4。

圖2 體外調(diào)控EphA1 表達對EPCsEphA1/SiRNA-Tet細胞增殖能力的影響

2.5 體外調(diào)控EphA1表達對EPCsEphA1/SiRNA-TetAkt通路的影響 1 μg/mL Dox（+）組、10 μg/mL Dox（+）組、100 μg/mL Dox（+）組及Dox（-）組中其下游的Akt、p-Akt、MMP-2和MMP-9的表達量都發(fā)生了相應(yīng)的變化。10 μg/mL Dox（+）組較Dox（-）組Akt相對表達量明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；10 μg/mL Dox（+）組較Dox（-）組的p-Akt和其下游MMP-2/MMP-9相對表達量都下降，差異有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），見圖5。

2.6 回輸EPCsEphA1/SiRNA-Tet體內(nèi)調(diào)控EphA1表達對裸鼠肝癌移植瘤成瘤體積的影響 第1～第4周時Dox（+）各濃度組皮下移植瘤體積與Dox（-）組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；第5～第6周時Dox（+）各組腫瘤體積增長均明顯減慢，其差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。而1 μg/mL Dox（+）組和10 μg/mL Dox（+）組裸鼠移植瘤體積在第6周時較Dox（-）組也明顯下調(diào)，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；而Dox（+）3組間比較差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見圖6。

2.7 回輸EPCsEphA1/SiRNA-Tet體內(nèi)調(diào)控EphA1表達對裸鼠肝癌移植瘤微血管密度的影響 光鏡下可見腫瘤被膜及癌巢之間結(jié)締組織中有較多血管。Dox（-）組各癌巢間結(jié)締組織明顯較多，且有結(jié)締組織伸入癌巢中，可見癌巢被結(jié)締組織分割為小結(jié)節(jié)狀，微血管為（37.0±4.1）個；而100 μg/mL Dox（+）組癌巢較大，癌巢之間亦有結(jié)締組織，但無明顯結(jié)締組織伸入癌巢內(nèi)的情況，微血管為（21.6±3.6）個，2組差異有統(tǒng)計學意義（t=2.823，P=0.024），見圖7。

3 討論

圖3 體外調(diào)控EphA1 表達對EPCsEphA1/SiRNA-Tet遷移能力的影響（×100）

圖4 體外調(diào)控EphA1 表達對EPCsEphA1/SiRNA-Tet侵襲能力的影響（×50）

圖5 體外調(diào)控EphA1 表達對EPCsEphA1/SiRNA-Tet Akt/MMP-2/MMP-9通路的影響

圖6 回輸EPCsEphA1/SiRNA-Tet體內(nèi)調(diào)控EphA1表達對裸鼠肝癌移植瘤體積的影響

圖7 裸鼠移植瘤微血管密度的免疫組織化學染色（×100）

肝癌是一種多血管性的腫瘤，抑制肝癌血管形成，切斷肝癌生長和轉(zhuǎn)移所依賴的“命脈”，已成為重要的抗癌戰(zhàn)略。研究表明骨髓起源的循環(huán)內(nèi)皮祖細胞能定向歸巢腫瘤的新生血管并參與血管生成[2]，利用內(nèi)皮祖細胞固有的腫瘤新生血管趨化性，能克服傳統(tǒng)細胞載體不能系統(tǒng)傳遞到所有腫瘤病灶的問題，同時目前以內(nèi)皮祖細胞為載體和靶點的腫瘤靶向血管生成治療也取得了卓有成效的進展[3-6]。然而以內(nèi)皮祖細胞為載體的基因治療和其他基因治療都存在著同一問題，即治療基因表達不受調(diào)控，治療基因的過度表達或不適當?shù)谋磉_不僅會影響治療結(jié)果，而且會對機體產(chǎn)生病理性損害，甚至會產(chǎn)生致命的不良反應(yīng)[7]，因此實現(xiàn)對基因表達的精確調(diào)控一直是腫瘤基因治療的熱點和難點[8]。本研究致力于建立一種可精確調(diào)控內(nèi)皮祖細胞中治療基因定時、定量表達的操作體系，使以內(nèi)皮祖細胞為載體和靶點的腫瘤抗血管生成治療更安全更高效。

四環(huán)素基因表達調(diào)控系統(tǒng)（Tet基因表達調(diào)控系統(tǒng)）是近年來發(fā)展起來的用于基因功能研究的新技術(shù)，該系統(tǒng)誘導(dǎo)因子是四環(huán)素及衍生物（目前大多用強力霉素）。利用該調(diào)控系統(tǒng)不僅能精確調(diào)控腫瘤細胞中目的基因的表達，還能精確調(diào)控干細胞中目的基因定時、定量地表達，而且這種調(diào)控并不會影響其自我更新及分化的能力[9]。

已往的研究發(fā)現(xiàn)EphA1/EphrinA1信號軸參與了肝癌的血管生成過程，通過免疫組織化學檢測證實，在肝癌的癌組織及血管內(nèi)皮細胞中存在EphA1及其配體EphrinA1蛋白的高表達[10]，細胞及動物水平研究發(fā)現(xiàn)利用EphA1 SiRNA可外源性地下調(diào)Huh-7肝癌細胞中EphA1基因的表達進而通過EphA1/EphrinA1信號軸抑制肝癌細胞運動及侵襲能力[11]，同時研究發(fā)現(xiàn)PI3K/Akt通路為EphA1/EphrinA1信號軸的下游信號[12]，可見EphA1/EphrinA1信號軸在肝癌血管生成過程中發(fā)揮重要的作用。近期我們已證實骨髓起源的內(nèi)皮祖細胞能特異性地靶向肝癌的的新生血管并參與血管生成[13]，在人外周血EPCs中也檢測到EphrinA1基因mRNA的表達[14]，由此推測EphA1/EphrinA1信號軸可能參與了內(nèi)皮組細胞歸巢肝癌新生血管的過程。

本研究利用前期構(gòu)建的受強力霉素調(diào)控可精確表達EphA1基因的內(nèi)皮祖細胞系EPCsEphA1/SiRNA-Tet，在體外研究中結(jié)果顯示10 μg/mL的強力霉素誘導(dǎo)可最大程度地抑制EphA1蛋白的表達，較之未調(diào)控組差異有統(tǒng)計學意義，EphA1蛋白的表達下調(diào)進而影響其配體EphrinA1的表達，最終達到調(diào)控EphA1/EphrinA1信號軸的目的；同時細胞生物學行為檢測結(jié)果表明，盡管下調(diào)EPCsEphA1/SiRNA-Tet細胞中EphA1基因表達時對其增殖能力無明顯影響，但下調(diào)EphA1/EphrinA1信號通路活性可明顯抑制EPCsEphA1/SiRNA-Tet細胞的運動能力和向細胞外基質(zhì)的侵襲能力，較未調(diào)控組差異均有統(tǒng)計學意義，且10 μg/mL的強力霉素誘導(dǎo)時效果最為顯著；而且以往研究表明PI3K/Akt信號傳導(dǎo)能對EphrinA1介導(dǎo)的肝癌細胞運動和侵襲能力產(chǎn)生影響[12]，因此通過Western blot驗證發(fā)現(xiàn)，在EPCsEphA1/SiRNA-Tet細胞中下調(diào)EphA1/EphrinA1信號通路活性，也能抑制Akt信號通路，同時其下游代表細胞運動和侵襲能力的MMP-2及MMP-9的表達也出現(xiàn)下調(diào)，且10 μg/mL的強力霉素誘導(dǎo)時效果明顯。另外活體實驗中通過體外飼以含不同濃度強力霉素的蔗糖溶液來調(diào)控活體內(nèi)EPCsEphA1/SiRNA-Tet細胞中EphA1 基因的表達，結(jié)果顯示盡管在EPCsEphA1/SiRNA-Tet細胞趨向腫瘤新生血管的早期未能明顯有效地抑制移植瘤的生長，然而當EPCsEphA1/SiRNA-Tet細胞整合入腫瘤新生血管后，下調(diào)EphA1 基因的表達能明顯抑制瘤的生長，且這種抑制效果在100 μg/mL強力霉素調(diào)控下效果最為明顯，同時進行了瘤組織免疫組織化學染色分析，結(jié)果顯示下調(diào)EphA1 基因的表達使瘤體內(nèi)微血管密度較未調(diào)控組明顯下調(diào)。體內(nèi)外研究結(jié)果證實成功的建立了一種可精確調(diào)控EPCsEphA1/SiRNA-Tet細胞中治療基因表達的系統(tǒng)，并在活體內(nèi)達到良好的調(diào)控效果，為以可調(diào)控治療基因表達的內(nèi)皮祖細胞為載體和靶點的肝癌抗血管生成治療提供了新的治療模式。