重組人乳脂肪球表皮生長因子8蛋白對大鼠缺血性癲癇發作的影響

符傳藝 趙杰 符媚媚 蔡仁端 黃良珍 陳建南 趙建農

1海南省人民醫院神經外科（海口570311）；2中南大學湘雅醫院神經外科（長沙410008）

癲癇發作是各類腦血管疾病發生腦缺血后常 見的臨床表現及嚴重并發癥，是影響預后的重要危險因素［1-2］。隨著監護手段提高，發現腦缺血后癲癇發作主要以非驚厥性癲癇為主要形式［3］，多項前期研究［4-6］表明缺血后腦組織的炎性反應導致神經元凋亡是癲癇發作的重要病理機制之一，凋亡神經元分解產物進一步誘發腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）等炎癥因子表達，炎癥反應加重，形成惡性循環。因此，抑制炎癥的發展是控制癲癇發作治療途徑之一，乳脂肪球表皮生長因子8 蛋白（milk fat globule epidermal growth factor 8，MFG-E8）作為一種抑炎因子，廣泛存在于腦組織中，由小膠質細胞分泌，能夠抑制TNF-α、IL-6 等炎癥因子表達，介導小膠質細胞吞噬凋亡神經元［7-8］。但尚未有研究MFG-E8 與腦缺血后非驚厥性癲癇發作的關系。本研究通過建立缺血后非驚厥性癲癇發作的大鼠模型，靜脈注射重組人乳脂肪球表皮生長因子8 蛋白（recombinant human milk fat globule epidermal growth factor 8，rhMFG-E8）進行治療，探討其在缺血后非驚厥性癲癇發作中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物健康雄性Wistar 大鼠，體質量（180 ± 20）g，由中南大學實驗動物中心提供。大鼠飼養于SPF 級清潔動物實驗室，室內相對濕度40% ～60%，溫度控制在22 ～25 ℃，12 h/12 h日夜光照條件下飼養。所有實驗操作過程均符合《中華人民共和國實驗動物管理條例》。

1.1.2 實驗試劑rhMFG-E8（廣州麗因生物科技有限公司）；TUNEL 染色相關試劑（廣州麗因生物科技有限公司），TNF-α（美國R＆D 公司）和IL-6 ELISA 試劑盒（美國R＆D 公司）等。

1.1.3 主要實驗儀器腦電圖監測儀（深圳邁瑞公司），激光多普勒流量計（Transonic，美國），分光光度計（BioTek，美國），蛋白濃度測定儀（Thermo，芬蘭），酶標儀（Thermo，芬蘭），蛋白轉膜儀（Leica，德國），離心機（Hettich，美國），電子天平（上海天平儀廠），熒光顯微鏡（Olympus，日本）等。

1.2 方法

1.2.1 大鼠缺血性癲癇模型制作及動物分組將36 只Wistar 大鼠以戊巴比妥（按體質量45 mg/kg）腹腔內注射麻醉滿意后，于大鼠頭雙側額頂部（分別于前囟前1 mm 及后4 mm，中線旁開3.5 mm）對稱性切開頭皮、鉆4 個孔至皮層，植入4 個不銹鋼電極，在橫竇與人字縫之間置一參考電極，所有電極均采用連接器固定于頭部，備腦電圖監測用，電極獲取腦電波后即傳輸至多參數顯示儀和數字分析系統。常規適應性飼養2 周，剔除頭部切口愈合不良者并遞補至36 只后隨機分為3 組，假性手術組，僅做頸部皮膚切口并暴露頸部動脈后縫合；缺血性癲癇組和rhMFG-E8 組采用改良Longa 線栓法建立急性腦梗死大鼠模型，大鼠按同樣的方法麻醉后仰臥固定于手術臺上，采用頸部正中切口，依次暴露并分離右側頸總動脈、頸外動脈及其分支、頸總動脈分叉處，以血管夾暫時夾閉阻斷頸外動脈及其分支上頜動脈及舌動脈。于頸總動脈分叉處近心端做一切口，將前端涂有石蠟的3-0 單股尼龍縫線插入頸總動脈并順血流方向，經頸內動脈入顱，插入深度約20 mm，至大腦前動脈近端，完全阻斷大腦中動脈起始部的血供，注意需短暫夾閉翼腭動脈以防誤插。手術過程采用激光多普勒流量計進行皮質腦血流量監測，皮質腦血流量下降70%以上以及術后1 h 監測到癲癇波者則定義為造模成功，缺血性癲癇組給予1 mL 生理鹽水靜脈注射。rhMFG-E8 組在模型建立成功后，立即按160 μg/kg 靜脈注射rhMFG-E8 溶液1 mL［9］。所有大鼠均在術前1 h 開始監測癲癇波，術后24 h斷頭取腦組織。缺血性癲癇組和rhMFG-E8 組大鼠模型制作過程中切口愈合不良者、皮質腦血流量下降不足70%者以及術后1 h 未監測到癲癇波者等均給予剔除，并依次遞補。

1.2.2 指標測定

1.2.2.1 癲癇波監測所有實驗動物在缺血前1 h開始進行腦電圖監測，直至缺血后24 h。腦電波由電極獲取并實時傳輸至多參數顯示儀和數字分析系統。確定腦缺血后非驚厥性癲癇波型按WILLIAMS 等［10］制定的評判標準：（1）腦電圖波幅大于背景波幅；（2）持續多棘波，或頻率大于1 Hz的棘波或棘慢復合波；（3）出現（1）和（2）波型持續10 s 以上。監測到癲癇波的頻率即為該大鼠的實際非驚厥性癲癇發作次數。

1.2.2.2 采用TUNEL 染色法檢測各組紋狀體區組織中神經元凋亡TUNEL 染色檢測凋亡的方法按照試劑盒說明書進行。選取各組大鼠的紋狀體腦組織切片，依次用以下試劑洗滌：二甲苯4 min 2 次；無水乙醇3 min 2 次；95%乙醇3 min；75%乙醇3 min；PBS 5 min。取出組織切片，晾干，向組織上方加一滴蛋白酶K溶液，于室溫條件孵育15 min，孵育完成后給予PBS 洗滌2 min，反復4 次。繼而于10%中性甲醛中固定10 min，反復PBS 洗滌5 min 共3 次。然后將組織切片置于乙醇乙酸混合液中浸泡約7 min，PBS 洗滌5 min，反復3 次。于10%中性甲醛中再次固定10 min。自然晾干，向組織上方加一滴3%的過氧化氫，觀察10 min 后PBS洗滌。自然晾干，在組織上方滴加一滴TdT 酶緩沖液，5 min 后PBS 反復洗滌2 次。37 ℃下預熱終止液，再把組織切片放置到終止液中20 min，取出后PBS 反復洗滌2 次。輕輕擦拭組織切片，加一滴過氧化物酶標記的抗體在組織上方，20 min 后用PBS 洗滌5 min，反復4 次。輕輕擦拭組織切片，向組織上方加DAB 顯色液，根據顯色程度確定顯色時間，一般控制在30 min 以內。完成顯色后置其于無水乙醇2 min，二甲苯2 min，在通風櫥中自然晾干，用熒光封片試劑封片。最后于2 h 內在熒光顯微鏡下觀察組織切片。陽性細胞胞核呈綠色，每張切片隨機選取區域拍照5 張，細胞數取平均值，以便后續對凋亡細胞進行統計，凋亡指數（apoptotic index）=陽性細胞/總細胞×100%。

1.2.2.3 ELISA 法檢測各組大鼠紋狀體中TNF-α、IL-6 表達提取大鼠的紋狀體腦組織準確稱取，加9 倍的4 ℃生理鹽水，經研磨攪拌制成10%的組織勻漿，完畢后于冰上靜置30 min 以便蛋白充分裂解，將勻漿液于4℃，12 000 r/min 離心15 min×2次，取上清液。按照ELISA 試劑盒說明進行后面實驗操作步驟。將勻漿上清液標準品稀釋液稀釋5 倍備用，從密封袋中取出板條，將稀釋好的樣品和標準品以100 μL/孔加入，用封板膠紙封住反應孔，37 ℃孵育120 min。洗板4 次，在濾紙上印干。將生物素化抗體工作液以100 μL/孔加入，將反應孔用封板膠紙封住，37.0 ℃孵育60 min。洗板4 次，在濾紙上印干。將酶結合工作液以100 μL/孔加入，封板膠紙密封反應孔，37 ℃孵育30 min。洗板4 次，在濾紙上印干。將顯色劑以100 μL/孔加入，37 ℃條件下孵育20 ～30 min。每孔加入50 μL 終止液，將溶液混勻，5 min 內測量波長在450 nm 處的吸光度OD值。

1.3 統計學方法采用SPSS 16.0 統計軟件進行數據分析，計量資料采用均數±標準差（）表示。多組樣本均數的比較如方差不齊時采用Welch 方差分析，組間兩兩比較采用Games-Howell檢驗。如多組樣本均數的比較方差齊時，則應用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Tukey 檢驗；設P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 rhMFG-E8 可明顯減輕缺血性癲癇大鼠的癲癇發作頻率所有入選實驗的大鼠自缺血前1 h開始進行腦電圖監測，直至缺血后24 h，并將腦電圖結果描記。實驗過程發現，3 組大鼠癲癇發作頻率總體有差異（WelchF= 676.91，P＜0.05）。3 組兩兩比較結果：缺血性癲癇組大鼠癲癇發作的頻率［（15.6±3.6）次/24 h］較假性手術組［（0.4±0.5）次/24 h］明顯升高（P＜0.05）；而rhMFG-E8 組癲癇發作的頻率［（7.8 ± 1.9）次/24 h］較缺血性癲癇組［（15.6±3.6）次/24 h］明顯降低（P＜0.05），rhMFGE8 明顯降低大鼠癲癇的發作頻率，差異有統計學意義。

2.2 rhMFG-E8 有效減輕缺血性癲癇大鼠紋狀體組織的細胞凋亡采用TUNEL 染色檢測了各組大鼠紋狀體組織中神經元凋亡水平（圖中類圓形綠色小體即為凋亡神經元）。結果顯示3 組神經元凋亡水平總體有顯著差異（WelchF= 676.91，P＜0.05）。假手術組大鼠紋狀體中幾乎無凋亡神經元（圖1）；缺血性癲癇組大鼠紋狀體中神經元凋亡［（15.28±1.95）%］，較假性手術組［（0.40±0.17）%］明顯增加（P＜0.05）。（圖2）；而經rhMFG-E8 處理后，大鼠紋狀體中神經元凋亡［（9.65 ± 1.17）%］較缺血組降低（圖3），差異有統計學意義。

圖1 假手術組紋狀體凋亡神經元（×200）Fig.1 Apoptotic neurons in striatum of the sham operation group（×200）

圖2 缺血性癲癇組大鼠紋狀體凋亡神經元（×200）Fig.2 Apoptotic neurons in striatum of postischemic seizure group（×200）

2.3 rhMFG-E8 有效抑制缺血性癲癇大鼠紋狀體組織中TNF-α和IL-6 表達結果顯示3 組TNF-α、IL-6 表達總體均有差異（F= 309.22，P＜0.05；F=290.87，P＜0.05）。與假手術組（195.0±29.5，120.3± 25.7）比較，缺血性癲癇組中紋狀體中炎癥因子TNF-α、IL-6 表達（590.4 ± 43.0，480.3 ± 49.8）增加（P＜0.05）；rhMFG-E8 可抑制TNF-α、IL-6（354.6 ±43.5，279.8 ± 29.9）表達，與缺血性癲癇組比較，差異具有統計學意義（P＜0.05，圖4）。

圖3 rhMFG-E8 組紋狀體凋亡神經元（×200）Fig.3 Apoptotic neurons in striatum of the rhMFG-E8 group（×200）

圖4 各組大鼠紋狀體中炎癥因子TNF-α、IL-6 表達Fig.4 Expression of TNF-αand IL-6 in striatum of rats in each group

3 討論

癲癇是腦梗死常見并發癥，尤其是非驚厥性癲癇，國內外多項基礎及臨床研究發現其是急性腦梗死的發生率非常高的并發癥，高達7% ～20%［11-13］。缺血后癲癇發作以顳葉、額頂葉皮質、紋狀體及邊緣系統等部位腦梗死多見，紋狀體損害癲癇發作常表現為發作性肌強直伴疼痛、出汗、恐懼感，但不伴意識喪失［14-15］。本研究結果顯示假手術組基本無炎癥反應和癲癇發作，相對假手術組，缺血性癲癇組缺血后24 h 內非驚厥性癲癇發作頻率明顯上升，與之相應是紋狀體腦組織炎性反應加劇，TNF-α、IL-6 表達顯著上升，而rhMFGE8 組TNF-α、IL-6 表達明顯下降，炎癥發應減輕，隨之癲癇發作頻率下降，揭示癲癇與炎癥呈正相關，該結論也得到相關文獻［16］支持。

小膠質細胞是中樞神經系統的一道重要免疫防御系統，腦組織缺血后以小膠質細胞活化為特征的炎癥是神經組織炎性損害的關鍵環節，小膠質細胞被激活并迅速釋放炎癥因子，在大腦組織和周圍血液中的濃度升高，早期研究證明腦組織缺血后的炎性反應加重導致神經元損傷及死亡，大腦電生理網絡完整性受破壞，誘發癲癇發作［17］。本研究結果顯示在各組之間，隨著炎癥反應加重，大鼠紋狀體急性缺血后神經元凋亡數目顯著增加，提示該病理變化與非驚厥性癲癇發作相關，與文獻［18-19］報告相符。所以，腦缺血早期通過抑制炎癥發生以及避免其級聯反應，減少神經元凋亡的途徑，可以避免癲癇發作及加重。因此，研究及尋找抑炎因子及機制是防治癲癇的重要研究方向之一。

MFG-E8 是一種分泌性糖蛋白，在中樞神經系統主要由小膠質細胞分泌，在急性腦缺血梗死炎癥反應過程中，其能夠識別凋亡細胞表面標志物絲氨酸磷脂，介導吞噬細胞及時清除凋亡細胞，避免凋亡細胞分解產物引發炎癥因子產生，激發炎癥級聯反應，導致腦組織繼發損傷［20］。MFG-E8能夠減輕急性腦梗死后炎癥反應，從而減少神經元凋亡，但至今尚未有MFG-E8 與癲癇發作具體機制的研究。

本研究結果顯示rhMFG-E8 具有強烈的抑炎作用，相對于缺血癲癇組，rhMFG-E8 組炎癥因子TNF-α、IL-6 表達顯著下降，同時發現紋狀體區神經元凋亡數量明顯減少，伴隨之是癲癇發作頻率顯著下降。所以，本研究證實大鼠急性腦缺血后rhMFG-E8 抑制炎性因子TNF-α 和IL-6 分泌，減輕急性腦缺血后炎癥反應，減少神經元凋亡，從而減輕或緩解癲癇發作。

通過以上實驗結果，筆者證實rhMFG-E8 通過減少或拮抗炎癥反應因子，從而阻止神經元凋亡，減輕腦組織損害，減少癲癇發作頻率。但本研究觀察時間為24 h 以內，雖然在建模成功后便立即靜脈給rhMFG-E8 治療有陽性的結果，但遠期療效尚未清楚，與轉化臨床運用之間尚有不少距離，且因受實驗條件及經費限制，也存在缺乏rhMFG-E8拮抗劑組比較等不足之處，在后續的補充實驗研究中需要解決這些問題。