復方苦參注射液增加肺癌H1299細胞放射敏感度的研究

鄭劍霄 郭偉偉 李清娟 郭婭妮 魏球娣 易夢婷 王蘇美 李工

廣州中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院，廣東省中醫(yī)院（廣州510120）

肺癌是最常見的惡性腫瘤之一，也是癌癥相關死亡的首要疾病［1-2］。肺癌的治療預后欠佳，患者的5年生存率只有約15%［3-4］。肺癌中約80%為非小細胞肺癌，大部分患者確診時已發(fā)展為中晚期［5］。目前，放療聯合化療的綜合治療是不可手術非小細胞肺癌的標準治療［6］，尤其適合于體力狀態(tài)較好，能耐受毒副反應的患者［7］。由于腫瘤細胞對放療抵抗導致局部治療失敗［8-9］，因此，提高肺癌細胞對放射線的敏感性是改善不可手術局部晚期非小細胞肺癌患者預后的重要途徑。復方苦參注射液是一種具有廣譜抗腫瘤作用的中藥制劑［10-11］，臨床研究發(fā)現其具有增強肺癌放射治療療效的作用［12］，但目前有關復方苦參注射液在肺癌放療增敏方面的基礎研究較少，為此，在細胞水平上進行這方面研究，旨在今后為其應用于臨床提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑復方苦參注射液（國藥準字Z14021231），由山西振東制藥股份有限公司生產，100 mL 含生藥40g ；胰酶（貨號：25200-056）、DMEM 培養(yǎng)基（貨號：C1195500BT）及胎牛血清（貨號：A3160801），購自美國Gibco公司；青霉素-鏈霉素（貨號：SV30010）及PBS緩沖液（貨號：SH30256.01），購自美國HyClone 公司；Annexin V-FITC/PI apoptosis Kit-AP101 細胞凋亡檢測試劑盒（貨號：AP101），購自中國聯科生物公司。

1.2 主要儀器5430R 低溫高速離心機（德國Eppendorf 公司）；FC500 流式細胞儀（美國Beckman公司）；Infinite M1000 PRO 多功能酶標儀（奧地利Tecan 公司）；IC1000 全自動細胞計數儀（美國Countstar 公司）；MultiRad225 放射儀器（美國Faxitron 公司）。

1.3 細胞培養(yǎng)及分組人肺癌H1299 細胞由廣東省中醫(yī)藥科學院提供，于飽和濕度的37 ℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞融合度達到70%～80%時傳代，取對數生長期細胞進行實驗。將細胞隨機分為空白對照組、單純放射組、苦參放射組。空白對照組：不給藥，不照射；單純放射組：只照射，不給藥；苦參放射組：予一定濃度的復方苦參注射液處理細胞24 h 后照射。

1.4 四甲基偶氮唑鹽（MTT）法檢測H1299 細胞增殖抑制率取指數生長期細胞接種于96 孔板，每孔200 μL，培養(yǎng)24 h，按2 倍梯度稀釋法加入復方苦參注射液，使其終濃度分別為1、2、4、8、16 mg/mL，每個劑量設5 孔，培養(yǎng)細胞24、48、72 h 后，棄上清，PBS 清洗，加MTT 溶液20 μL/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4 h 后，棄上清，加入150 μL DMSO，震蕩10 min，測定450 nm 時的吸光度（OD）值，實驗重復3 次。按以下公式計算抑制率，擬合后求IC50值和IC20值。細胞增殖抑制率（%）=［對照組OD值-實驗組OD值/對照組OD值］×100%。藥物作用后，細胞增殖抑制率＜20%時，藥物對細胞的毒性作用可相對忽略，因此選擇復方苦參注射液作用24 h 時的IC20進行試驗。取指數生長期細胞隨機分為空白對照組、單純放射組、苦參放射組，X 射線照射劑量分別為2、4 Gy，計算各組的細胞增殖抑制率。實驗重復3 次后取均值。

1.5 流式細胞術檢測細胞凋亡接種1×105個細胞于60 mm 培養(yǎng)皿中，細胞分組同1.4，X 射線照射劑量為2 Gy，處理后PBS 沖洗待檢測細胞，離心后棄上清液，加500 μL Binding Buffer 重懸細胞，并加入5 μL Anneexin V-FITC 和10 μL PI 染色液，混勻后置于室溫避光反應5 min，使用流式細胞儀檢測。實驗重復3 次后取均值。

1.6 細胞克隆形成試驗檢測細胞存活率取指數生長期細胞接種于培養(yǎng)皿中，細胞分組同1.4，X 射線照射劑量為2 Gy，細胞照射后繼續(xù)培養(yǎng)10～14 d，倒掉培養(yǎng)基，PBS 沖洗，4%多聚甲醇固定，0.1%結晶紫染色10 min，于熒光顯微鏡下計數克隆數。克隆形成率=克隆數/細胞接種數×100%，細胞存活率=處理組克隆形成率/對照組克隆形成率。

1.7 統計學方法使用SPSS 21.0 統計軟件對數據進行統計學分析，計量資料結果以表示，多組間樣本均數比較采用單因素方差分析，組間比較采用t檢驗，以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 復方苦參注射液對H1299 細胞的藥物毒性不同濃度復方苦參注射液處理H1299 細胞24、48、72 h 后，各處理組細胞抑制率較對照組增加，差異具有統計學意義（P＜0.05）。且隨著時間的延長，各處理組的細胞抑制率也逐漸升高，提示復方苦參注射液對H1299 細胞增殖的抑制作用呈現一定的劑量和時間依賴關系。復方苦參注射液處理H1299 細胞24、48、72 h 的IC50分別為14.46、8.51、3.52 mg/mL。復方苦參注射液處理H1299 細胞24、48、72 h 的IC20分別為2.97、0.94、0.42 mg/mL。見表1、圖1。

表1 復方苦參注射液對H1299 細胞的抑制作用Tab.1 Inhibition of compound kushen injection on H1299 cells±s

表1 復方苦參注射液對H1299 細胞的抑制作用Tab.1 Inhibition of compound kushen injection on H1299 cells±s

劑量（mg/mL）抑制率（%）0 1 2 481 6 24 h 0.00±0.00 9.98±5.35 14.63±5.16 23.18±2.04 32.40±4.30 53.01±4.81 48 h 0.00±0.00 23.36±2.15 27.08±4.28 43.87±5.75 52.45±0.76 68.94±3.51 72 h 0.00±0.00 38.28±3.62 43.10±3.36 54.99±3.04 68.35±2.35 85.63±2.79

2.2 復方苦參注射液聯合放射對H1299細胞增殖水平的影響當增加復方苦參注射液干預后，可明顯增強放射線對H1299 細胞增殖的抑制作用，放射劑量2、4 Gy 時的抑制率分別為（33.03±2.49）%、（34.00±1.67）%，高于單純放射組的（12.73±10.06）%、（15.44±5.34）%，差異具有統計學意義（P＜0.05），提示復方苦參注射液聯合放射抑制H1299 細胞顯示出協同作用。見表2。

圖1 不同濃度復方苦參注射液對H1299 細胞生長的抑制作用Fig.1 Inhibition of compound kushen injection at different concentrations on H1299 cells

表2 復方苦參注射液聯合放射對H1299 細胞的抑制作用Tab.2 Inhibition of radiation combined with compound kushen injection on H1299 cells

2.3 復方苦參注射液對H1299 細胞凋亡的影響單純放射組H1299 細胞的凋亡率（6.4 ± 0.4）%，高于空白對照組的（2.4 ± 0.3）%，差異具有統計學意義（P＜0.05），提示放射線誘導H1299 細胞凋亡。苦參放射組H1299 細胞的凋亡率（11.0 ± 0.3）%，較單純放射組增加，差異具有統計學意義（P＜0.05），提示復方苦參注射液能促進放射線誘導H1299 細胞凋亡。見圖2。

2.4 復方苦參注射液對放射后H1299 細胞存活率的影響單純放射組H1299 細胞存活率為（16.3 ±1.5）%，經復方苦參注射液處理后，H1299 細胞存活率減少至（12.0 ± 1.0）%，差異具有統計學意義（P＜0.05）。見圖3。

3 討論

圖2 各組H1299 細胞凋亡情況比較Fig.2 Comparison of apoptosis of H1299 cells in various groups

圖3 各組細胞克隆形成情況Fig.3 Clone formation of cells in various groups

復方苦參注射液是以苦參、白土苓兩味中藥經現代技術加工制成，氧化生物堿是其主要活性成分。氧化苦參堿通過抑制腫瘤細胞增殖、誘導腫瘤細胞凋亡、抑制端粒酶的活性、抑制腫瘤新生血管的形成等多種途徑發(fā)揮其抗腫瘤活性［13-14］。本研究采用體外細胞實驗檢測藥物的放射增敏作用具有方便快捷的優(yōu)勢，MTT 法顯示當增加復方苦參注射液干預后，可明顯增強放射線對H1299細胞增殖的抑制作用，進一步采用經典的克隆形成法也證實了復方苦參注射液對H1299 細胞具有放射增敏作用。

細胞凋亡在放射反應機制中占有重要地位，放射敏感性與腫瘤細胞自發(fā)性凋亡水平呈正相關趨勢［15-16］，腫瘤細胞凋亡率越高，放射敏感性越強［17-19］。對肺癌細胞株的研究也證實肺癌細胞放射敏感性與凋亡率呈正相關［20］。本研究通過流式細胞儀檢測，發(fā)現苦參放射組肺癌細胞的凋亡率較單純放射組增加，克隆形成實驗結果表明苦參放射組肺癌細胞存活率降低即放射敏感度增高，提示復方苦參注射液通過促進放射線誘導的肺癌細胞凋亡，從而增加肺癌細胞的放射敏感度。

筆者推測復方苦參注射液可通過抑制H1299肺癌細胞增殖，促進肺癌細胞凋亡，從而提高肺癌細胞的放射敏感度。但本研究尚停留在體外細胞實驗階段，且未對復方苦參注射液放射增敏作用的分子機制進行深入分析，未來應該通過動物實驗和臨床研究進一步探討復方苦參注射液對肺癌細胞的放射增敏作用。