NUAK1在鼻咽癌組織中的表達及其對鼻咽癌CNE2、HK1細胞遷移和侵襲能力的影響

蘇琪盛 張里謙 黎小紅 羅玉珍 覃柳群 丘玉鈴 楊崢 莫武寧

廣西醫科大學第一附屬醫院檢驗科（南寧530021）

鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）起源 于鼻咽部上皮細胞，是我國最常見的頭頸部惡性腫瘤之一，其發病率和病死率在我國南方地區居世界首位［1-2］。鼻咽癌起病隱匿，病情進展迅速，容易發生頸部淋巴結轉移和遠處轉移。目前，放射治療是鼻咽癌的主要治療方法，然而晚期患者治療效果不佳，許多患者治療后易出現放療抵抗和發生局部復發，因此鼻咽癌的治療仍具有挑戰性［3-5］。早期診斷可使患者得到更及時和更高效的治療。為此，篩選鼻咽癌早期診斷的生物標志物，尋找新的藥物治療靶點是當前研究的熱點。

NUAK1（NUAK family kinase 1），又名ARK5，作為人腺苷單磷酸（AMP）激活蛋白激酶（AMPK）家族成員之一，是AKT 的下游信號分子［6］。AKT在調節腫瘤細胞生長、增殖，促進細胞轉移和侵襲等多種影響到腫瘤發生發展的過程中起著重要作用［7］。據報道，NUAK1 在體內參與多種生理病理過程，如促進細胞增殖，抑制凋亡，調控血管生成等，并與腫瘤的發生發展密切相關［8］。NUAK1 在部分腫瘤如乳腺癌［9］、肝癌［10］、胰腺癌［11］等組織中高表達，并且在腫瘤的轉移和侵襲中發揮重要作用。但是，NUAK1 在鼻咽癌組織中的表達情況以及NUAK1 對鼻咽癌細胞生長的影響尚未明確。本研究擬通過實時熒光定量PCR（qRT-PCR）技術和免疫組織化學染色的方法對鼻咽癌組織和鼻咽黏膜慢性炎癥組織中NUAK1 mRNA 和蛋白的表達水平進行檢測，并對NUAK1 的表達與鼻咽癌臨床病理特征之間進行相關性分析。進一步沉默鼻咽癌細胞株CNE2、HK1 中NUAK1 的表達，觀察NUAK1 表達下調的CNE2、HK1 細胞株中遷移和侵襲能力的變化，探討NUAK1 與鼻咽癌發生發展的關系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 組織和細胞用于進行核酸擴增的16 例鼻咽癌和16 例鼻咽黏膜慢性炎組織標本獲取自廣西醫科大學第一附屬醫院耳鼻喉科。在16 例鼻咽癌患者組織標本中男13 例，女3 例，年齡分布范圍為32 ～78 歲，中位年齡51 歲。在16 例鼻咽黏膜慢性炎組織標本中，男10 例，女6 例，年齡分布范圍為25 ～77 歲，中位年齡44 歲。

用于本次研究中免疫組織化學染色的組織標本石蠟切片獲取自廣西醫科大學第一附屬醫院病理科。包含88 例鼻咽癌組織樣本及30 例鼻咽黏膜慢性炎樣本，在88 例鼻咽癌組織標本石蠟切片中男63 例，女25 例，年齡分布范圍為16 ～71 歲，中位年齡47 歲；切片樣本病理類型：非角化型未分化性癌77 例，非角化型分化性癌11 例；淋巴結轉移：伴有淋巴結轉移81 例，無淋巴結轉移7 例；根據國際抗癌聯盟（Union for International Cancer Control，UICC）2010年制定的鼻咽癌分期法進行分期：Ⅰ和Ⅱ期共計11 例，Ⅲ和Ⅳ期共計77 例；腫瘤病理分期：T1、T2期21 例，T3、T4期67 例。在30 例鼻咽黏膜慢性炎組織標本中男23 例，女7 例，年齡18 ～69 歲，中位年齡44 歲。以上所有患者均未經過放療和化療。本研究經廣西醫科大學第一附屬醫院倫理道德委員會批準，并取得受試者知情同意。

本次研究以鼻咽癌細胞株CNE2、HK1 為研究對象，這兩株細胞株由廣西醫科大學耳鼻喉實驗室贈予本課題組。將CNE2 和HK1 細胞株在含有10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素混合溶液的RPMI 1640 培養基中培養，培養條件為37 ℃，5%CO2。

1.1.2 主要實驗試劑siRNA-NUAK1（序列：AGAGAGAATCAGGTTACTA）和siRNA CON054 購自上海吉凱基因化學技術有限公司。總RNA 提取試劑RNAiso Plus reagent，反轉錄試劑盒Prime-ScriptTMRT reagent Kit，熒光定量PCR試劑盒SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ均購自日本TaKaRa 公司。抗NUAK1 抗體（ab37641）購于美國abcam 公司，兔鼠通用型SP-9002 試劑盒和DAB 顯色液購于北京中杉金橋公司，抗GAPDH 抗體（2118S）和熒光二抗（5151P）購于CST 公司。RPMI 1640 培養基、胰酶消化液購自Gibco 公司，胎牛血清購自LONSERA公司，青霉素-鏈霉素混合溶液、嘌呤霉素、RIPA蛋白裂解液等購自北京索萊寶公司。Transwell 小室和24 孔板等購自美國Corning 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 篩選差異表達基因從oncomine 數據庫（https：//www.oncomine.org）中獲取包含31 例鼻咽癌和10 例正常鼻咽組織的全基因組芯片數據GSE12452（GPL570［HG-U133_Plus_2］Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array）。對全部基因進行差異表達分析，差異表達倍數（Fold Change）≥2 且P＜0.05。

1.2.2 qRT-PCR 檢測NUAK1 mRNA 表達按照RNAiso Plus reagent 操作說明使用Trizol 法提取組織和細胞中的總RNA，無酶水溶解沉淀。使用反轉錄試劑盒PrimeScriptTMRT reagent Kit 將mRNA逆轉錄成cDNA，并按照熒光定量PCR 試劑盒SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ說明書進行定量PCR 反應。以GAPDH 作為內參基因，引物購自上海擎科公司，目的基因NUAK1 和內參基因GAPDH 引物序列及擴增片段大小見表1。實驗重復3 次。

1.2.3 免疫組織化學方法檢測NUAK1 蛋白表達采用免疫組化SP 法，將免疫組化切片常規脫蠟，梯度酒精逐級水化，隨后檸檬酸鹽緩沖液（pH 6.0）高溫高壓修復抗原。一抗NUAK1 濃度為1∶100，切片置于4 ℃過夜，按照試劑盒說明書操作。DAB顯色后蘇木素復染，每張切片均隨機選擇5 個高倍視野（400×）進行觀察。每張切片經過兩名研究人員進行評分。

表1 引物序列及擴增片段大小Tab.1 Primer sequence and amplified fragment size

NUAK1 陽性染色主要定位于細胞漿中，呈棕黃色顆粒。在視野下計數100 個細胞，以細胞漿中出現淺黃、棕黃或棕褐色的細小顆粒為陽性細染色為主要判定標準。陽性細胞染色強弱：0 分（無陽性著色）、1 分（淺黃色）、2 分（棕黃色）、3 分（棕褐色）。陽性細胞百分比：1 分（＜10%）、2 分（10%～50%）、3 分（50%～75%），4 分（＞75%）。兩項乘積≥6 分為高表達，≤4 分為低表達。

1.2.4 細胞轉染取對數期生長良好的CNE2、HK1 細胞，以轉染siRNA-NUAK1 的細胞株為實驗組，轉染空載片段siRNA CON054 的細胞株為空載組，分別將含有NUAK1 基因片段和空載片段的慢病毒轉染至CNE2、HK1細胞株中。轉染72 h后，各轉染組用含2 μg/mL 嘌呤霉素的培養基篩選穩定細胞株。提取mRNA，進行qRT-PCR 檢測siRNANUAK1 干擾效果。

1.2.5 Transwell細胞遷移實驗將底部膜含8 μm大小孔隙的小室置于24 孔板上，下室加入500 μL含有10%胎牛血清的RPMI1640 完全培養基。分別將含4×104個實驗組和空載組細胞的無血清細胞懸液加入上室，培養24 h 后取出小室，4%多聚甲醇固定細胞30 min，1%結晶紫染液染色20 min。室溫下晾干小室，顯微鏡下隨機計數5 個視野的穿膜細胞數。

1.2.6 細胞侵襲實驗在小室內加入100 μL 適當濃度的Matrigel，4 h 待稀釋后的Matrigel 變成固態后，下室和上室分別加入500 μL 含有10%血清的完全培養基和4×104個實驗組和空載組細胞的無血清細胞懸液，培養24 h 后取出小室，固定，結晶紫染色后，在顯微鏡下隨機計數5 個視野穿膜細胞數。

1.3 統計學方法采用SPSS 22.0 軟件進行統計分析，計量資料用均數±標準差表示。計數資料之間的比較采用χ2檢驗，計量資料之間的比較采用兩獨立樣本t檢驗。P＜0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 NUAK1 在鼻咽癌芯片中高表達在31 例鼻咽癌和10 例正常鼻咽組織的全基因組芯片數據中，NUAK1 在鼻咽癌組織中的表達高于正常鼻咽組織（P＜0.05）。見圖1。

圖1 NUAK1 在鼻咽癌和正常鼻咽組織的表達（oncomine數據庫）Fig.1 Expression of NUAK1 in nasopharyngeal carcinoma and normal nasopharyngeal tissue（oncomine database）

2.2 NUAK1 mRNA在鼻咽癌組織中的表達qRTPCR 結果顯示在16 例鼻咽癌和16 例鼻咽黏膜慢性炎組織中NUAK1 mRNA 的表達水平分別為（2.52 ± 1.61）和（1.31 ± 0.78）。鼻咽癌組織中NUAK1 mRNA 的表達量明顯高于鼻咽黏膜慢性炎組織（P＜0.05）。見圖2。

圖2 NUAK1 mRNA 在鼻咽癌和鼻咽黏膜慢性炎組織的相對表達水平Fig.2 Relative expression levels of NUAK1 mRNA in nasopharyngeal carcinoma and chronic inflammation of nasopharyngeal mucosa

2.3 NUAK1蛋白在鼻咽癌組織中的表達在88例鼻咽癌及30 例鼻咽黏膜慢性炎組織標本石蠟切片中，免疫組化結果顯示NUAK1 蛋白在52 例鼻咽癌組織中高表達，在36 例鼻咽癌組織中低表達；NUAK1 蛋白在8 例鼻咽黏膜慢性炎組織中高表達，在22 例鼻咽黏膜慢性炎組織中低表達。鼻咽癌組織的NUAK1 蛋白表達率明顯高于鼻咽黏膜慢性炎組織（P＜0.05）。見圖3。另外，鼻咽癌中NUAK1 蛋白的表達與淋巴結轉移相關（P＜0.05），與年齡、性別、T 分期、臨床分期等無相關（P＞0.05），見表2。

圖3 NUAK1 蛋白在鼻咽癌和鼻咽黏膜慢性炎組織中的表達（免疫組化，400×）Fig.3 Expression of NUAK1 protein in nasopharyngeal carcinoma and chronic inflammation of nasopharyngeal mucosa（immunohistochemistry，400×）

2.4 實驗組細胞中NUAK1 表達下降應用qRTPCR 檢測NUAK1 mRNA 的表達，結果顯示：CNE2細胞株實驗組和空載組的NUAK1 mRNA 相對表達量分別為（0.17 ± 0.01）、（1.00 ± 0.02），實驗組CNE2 細胞NUAK1 mRNA 相對表達量明顯低于空載組（P＜0.01）；HK1 細胞株實驗組和空載組的NUAK1 mRNA 相對表達量分別為（0.06 ± 0.01）、（1.00±0.01），實驗組HK1 細胞NUAK1 mRNA 相對表達量明顯低于空載組（P＜0.001），表明siRNANUAK1 CNE2 細胞和HK1 細胞均構建成功。見圖4。

2.5 沉默NUAK1 對鼻咽癌細胞株CNE2、HK1 遷移和侵襲能力的影響Transwell 遷移實驗結果顯示，沉默NUAK1后CNE2、HK1細胞實驗組穿膜細胞數分別為（176.40±9.76）、（99.00±7.62）個，CNE2、HK1 細胞空載組穿膜細胞數分別為（233.20 ±6.25）、（186.20 ± 5.91）個。實驗組穿膜細胞數明顯少于空載組（P＜0.05），提示沉默NUAK1 后鼻咽癌細胞CNE2、HK1 遷移能力減弱，見圖5。

表2 NUAK1 蛋白表達與鼻咽癌臨床病理學指標的關系Tab.2 Relationship between NUAK1 protein expression and clinicopathological indexes of nasopharyngeal carcinoma 例

圖4 NUAK1 mRNA 在不同細胞中的相對表達量Fig.4 The relative expression of NUAK1 mRNA in different cells

Transwell 侵襲實驗結果顯示，沉默NUAK1 后CNE2、HK1 細胞實驗組穿膜細胞數分別為（24.20± 2.92）、（54.00 ± 8.62）個，CNE2、HK1 細胞空載組穿膜細胞數分別為（93.00 ± 3.54）、（173.60 ± 9.32）個。實驗組穿膜細胞數明顯少于空載組（P＜0.05），提示沉默NUAK1 后鼻咽癌細胞CNE2、HK1侵襲能力減弱，見圖6。

圖5 沉默NUAK1 對鼻咽癌細胞CNE2、HK1 遷移能力的影響（24 h，200×）Fig.5 Effect of NUAK1 silencing on CNE2 and HK1 migration of nasopharyngeal carcinoma cells（24 h，200×）

圖6 沉默NUAK1 對鼻咽癌細胞CNE2、HK1 侵襲能力的影響（24 h，100×）Fig.6 Effect of NUAK1 silencing on CNE2 and HK1 invasion ability of nasopharyngeal carcinoma cells（24 h，100×）

3 討論

鼻咽癌的發生發展是一個多階段、多因子參與的復雜過程，而腫瘤的惡性程度與其浸潤轉移相關。據報道，AKT 在促進細胞轉移和侵襲中起著重要作用［7］，AKT/NUAK1 通路是決定腫瘤細胞的浸潤和轉移的關鍵腫瘤侵襲相關因子之一［8］。近年來，越來越多的證據表明NUAK1 在腫瘤的轉移和侵襲中發揮重要作用。HUANG 等［11］報道NUAK1 蛋白表達在10 對人胰腺癌組織高于相應的相鄰正常組織，并且促進了胰腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲。CHANG 等［12］研究得出在AKT 的調控下，ARK5 可能通過MMP2、MMP9 的激活增強了乳腺癌MDA-MB-231 細胞的侵襲和轉移潛能。CHEN 等［13］研究表明NUAK1 表達與胃癌腫瘤轉移和患者生存密切相關，可能通過上皮-間質轉換（EMT）改變參與胃癌細胞的遷移和侵襲。眾所周知，EMT 指上皮細胞在特定的生理或病理情況下向間質細胞轉化的現象，在腫瘤的發生發展中扮演重要的角色。在鼻咽癌中，多種抑癌或促癌的基因或者非編碼RNA 已被報道通過EMT 途徑參與到鼻咽癌的發生發展之中，如鈣網蛋白通過誘導細胞EMT 促進鼻咽癌遷移和侵襲［14］、miR-124則可能通過Akt 信號通路抑制鼻咽癌細胞株EMT，并增加鼻咽癌細胞的放療敏感性［15］。然而，目前NUAK1 基因對鼻咽癌細胞的生物學功能的影響尚未見報道，NUAK1 在鼻咽癌中的作用是否與EMT相關尚未明確，因此這將是筆者下一步研究的重點。

本研究首先從GEO 數據庫中獲取了31 例鼻咽癌和10 例正常鼻咽組織的全基因組芯片數據，發現NUAK1 基因在鼻咽癌的表達是正常鼻咽組織的2.18 倍。在侵襲能力較高的頭頸部癌癥中，NUAK1 已被證實與頭頸部癌癥的侵襲和淋巴結轉移密切相關［16］。LIU 等［17］也用免疫組化方法驗證了NUAK1 蛋白在鼻咽癌中高表達，并且高NUAK1表達與鼻咽癌的預后不良相關。進一步收集人鼻咽癌和鼻咽黏膜慢性炎組織，通過qRT-PCR 技術發現NUAK1 mRNA 在鼻咽癌中高表達，免疫組化方法驗證了NUAK1 蛋白在鼻咽癌中的表達高于鼻咽黏膜慢性炎，并且NUAK1 蛋白的表達與鼻咽癌淋巴結的轉移相關。筆者推測NUAK1 是鼻咽癌侵襲轉移的關鍵因子，可能作為淋巴結轉移的靶向治療。

腫瘤細胞遷移、侵襲能力是腫瘤浸潤、轉移和復發的重要因素，是許多惡性腫瘤患者死亡的主要原因。為了更好地了解NUAK1 基因可能在鼻咽癌侵襲轉移中發揮的作用，本研究設計了siRNA-NUAK1，沉默NUAK1 在鼻咽癌細胞株CNE2、HK1 的表達，發現NUAK1 表達下調的CNE2、HK1細胞株中遷移和侵襲能力均下調，說明NUAK1 基因在鼻咽癌的浸潤轉移中發揮正向調控作用。然而，NUAK1 如何影響鼻咽癌細胞的遷移與侵襲的機制尚未明確。腫瘤細胞的EMT 使其獲得侵襲和遷移能力，激活腫瘤細胞EMT 發生的分子機制是目前研究腫瘤轉移的熱點［18-19］。近年來的研究表明在胃癌、頭頸部癌癥中，NUAK1 誘導EMT 有利于腫瘤細胞的侵襲轉移［13，15］。因此，筆者推測NUAK1 與EMT 在鼻咽癌的浸潤轉移中也存在一定的關系，這有待進一步實驗證實。

綜上所述，本研究發現NUAK1 基因在鼻咽癌中表達上調，并且與淋巴結轉移密切相關。通過siRNA 技術干擾NUAK1 的表達可以顯著抑制鼻咽癌細胞的遷移和侵襲能力，提示NUAK1 可能是一種與鼻咽癌浸潤轉移有關的分子標志物，但NUAK1 對抑制鼻咽癌進展的分子機制及其臨床應用價值尚未明確，有待后續深入研究。