微池頂空萃取GC-MS法分析香茅草揮發性風味成分

施志凡，尹金芳，左怡丹，熊華斌，楊志，高云濤*,戴建輝*

(云南民族大學化學與環境學院，云南省生物高分子功能材料工程技術研究中心，昆明 650500)

香茅草[Cymbopogoncitratus(DC.) Stapf]別名檸檬草，禾本科草本植物，在我國主要分布于華南、西南等地[1]。因其具有獨特的芳香風味，具有疏風通絡、和胃通氣、安神醒腦等藥理功效，廣泛應用于食品調料中[2]。香茅草含有多種揮發性風味成分，且含量較高[3]，因此對其揮發性成分的研究受到關注[4]。李國明等[5]采用水蒸氣蒸餾法分離、GC-MS分析，從瑞麗檸檬香茅草中鑒定出桂花醛、檸檬醛、香茅醇等43種揮發性成分；喻世濤等[6]同樣采用水蒸氣蒸餾法獲得不同香茅草中的揮發性成分，經GC-MS鑒定出檸檬烯、香茅醛、香茅醇、香葉酯等34種揮發性成分。

頂空微萃取技術包括頂空固相微萃取、單滴頂空微萃取，因其具有自動便捷、快速高效、功能多樣等優點[7-9]，在揮發性風味物質分析中獲得廣泛應用[10-12]。固相微萃取操作方便、無需溶劑、靈敏度高，但其成本較高，多次使用后可能出現萃取頭交叉污染等問題[13-15]；單滴頂空微萃取雖成本低、裝置簡單、有機溶劑用量少，但亦存在萃取劑懸掛穩定性差和有機溶劑揮發損失過快的問題，導致無法使用乙酸乙酯、石油醚等揮發性有機溶劑。近年來，離子液體具有較低的蒸汽壓、揮發損失小[16-18]，在單滴頂空微萃取中的應用受到關注，但因其密度大、易脫落，且不能等其他有機溶劑反萃取后才能進行分析檢測將其應用于單滴頂空微萃取[19,20]。

本文制作了一種新型的微池頂空微萃取裝置，使用揮發性乙酸乙酯作為萃取劑，實現了香茅草揮發性成分的頂空微萃取，結合GC-MS對香茅草主要風味成分進行了分析[21]。本文提及的裝置克服了溶劑懸掛穩定性差的問題，萃取劑用量大幅增加，更重要的是，該裝置可使用萃取性能優良的乙酸乙酯等揮發性溶劑為頂空萃取劑，且簡單易操作、快速分析、萃取效率高，作為揮發性風味物質的快速分析方法，具有良好的應用前景。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

香茅草樣品采于云南省德宏州芒市中山鄉，經教育部-國家民委民族藥資源化學重點實驗室楊青松副教授鑒定為禾木科香茅屬檸檬草[Cymbopogoncitratus(DC.) Stapf]，采集的香茅草樣品將莖葉部分清洗，風干，切成小段放入粉碎機中研磨至60目以下，置于密封袋內冷藏保存。

1.1.2 試劑

正己烷(色譜純)、乙酸乙酯(色譜純)、石油醚(色譜純)、1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽離子液體[C4MIM][BF4](上海阿拉丁生化科技股份有限公司)。

1.2 儀器與設備

1.2.1 儀器

KO733B730000080氣質聯用儀 美國賽默飛世爾科技公司；微量進樣器(50.0，10.0 μL) 上海安亭科學儀器廠；20 mL鉗口頂空瓶。

1.2.2 微池頂空萃取裝置

本文采用微池萃取裝置代替進樣針單滴微萃取裝置，見圖1。

圖1 微池頂空萃取裝置結構(a)及微池剖面(b)

該裝置包括吸盤、掛柱、微池三部分，均為四氟乙烯材料，微池內最多可容納200.0 μL萃取劑，掛柱一端與微池通過卡口連接，另一端與吸盤連接，吸盤與頂空瓶墊片吸合，從而使微池探入頂空瓶內。使用時將樣品置于頂空瓶底部，將帶有微池的頂空瓶蓋與頂空瓶口密閉鉗合，用微量進樣器吸取適量萃取劑，針頭刺破頂空瓶墊并將萃取劑注入微池中，在一定溫度下頂空萃取一定時間，用進樣器吸出微池中的剩余萃取劑進行后續分析。

1.3 方法

1.3.1 單滴頂空微萃取

用10.0 μL微量進樣器移取一定體積的萃取劑，進樣器針頭刺入頂空瓶內，針尖到達頂空瓶1/3位置處，推送萃取液形成液珠懸掛于微量進樣器針尖，在一定溫度下，懸掛一定時間，將萃取劑吸回微量進樣器內讀取其剩余體積，進行后續分析，離子液體萃取劑用正己烷反萃取后[22]，進行后續分析。

1.3.2 微池頂空萃取

稱取1.5 g香茅草樣品加入頂空瓶中，根據1.2.2中圖1的微池頂空萃取裝置，用微量進樣器移取一定體積萃取劑，進樣器針頭刺入頂空瓶內，將萃取劑注入微池內，在一定溫度下萃取一定時間，用進樣器吸出微池中的剩余萃取劑，讀取其剩余體積，進行后續分析。

1.3.3 GC-MS分析

1.3.3.1 色譜條件

色譜柱：DB-WAX(30 m×0.25 m×0.25 μm)毛細管色譜柱；進樣口溫度220 ℃，檢測器溫度220 ℃；柱初溫45 ℃，保持3 min，以10 ℃/min升到90 ℃，保持2 min；再以6 ℃/min升到200 ℃，保持5 min；高純氦氣(純度>99.999%)；載氣流速1.0 mL/min；分流比10∶1；進樣量1.0 μL。

1.3.3.2 質譜條件

電子轟擊離子源(EI)；傳輸線溫度280 ℃；離子源溫度260 ℃；電子能量70 eV；質量掃描范圍30～500 m/z。

2 結果與討論

2.1 微池頂空萃取條件下4種萃取劑的穩定性

圖2 不同萃取時間下萃取劑的剩余量

本文選擇正己烷、乙酸乙酯、石油醚、離子液體([C4MIM][BF4])4種頂空萃取劑測試其在進樣針針尖上的懸掛量，最大懸掛量為：離子液體(4.9 μL)>石油醚(4.7 μL)>正己烷(4.4 μL)>乙酸乙酯(4.0 μL)，均不超過5.0 μL，這說明上述溶劑由于重力、表面張力、沸點、蒸汽壓、粘度等性質影響，其在進樣針針尖的懸掛穩定性通常較差，可懸掛溶劑量較少。進一步考察正己烷、乙酸乙酯、石油醚、[C4MIM][BF4]離子液體4種萃取劑在單滴頂空微萃取過程中的揮發穩定性，由圖2a可知，室溫(20 ℃)條件下，當萃取劑初始體積為4.0 μL時，4種萃取劑的回收量隨萃取時間的變化，除[C4MIM][BF4]離子液體具有較好的揮發穩定性外，石油醚、乙酸乙酯和正已烷的回收量迅速減小，4 min之內，幾乎揮發殆盡，這表明由于進樣針針尖所能懸掛的萃取劑量很小，除低揮發的離子液體等溶劑之外，正己烷、乙酸乙酯、石油醚等萃取性能優良的有機溶劑并不適用于單滴頂空微萃取過程。

針對單滴頂空微萃取裝置存在的萃取劑穩定性問題，本文設計的微池頂空萃取裝置(見圖1)將萃取劑置于微池中而不是懸掛于進樣針針尖，相對單滴頂空微萃取法，微池頂空萃取萃取劑初始用量可達到200 μL，增加數十倍，由圖2b可知，當萃取劑初始用量50.0 μL時，室溫(20 ℃)條件下頂空萃取3種揮發性萃取劑的回收量依次為：石油醚(6.0 μL)<正己烷(12.0 μL)<乙酸乙酯(27.0 μL)，明顯優于單滴頂空微萃取裝置。

在萃取劑初始用量50.0 μL和萃取時間20 min條件下，微池頂空萃取溫度對萃取劑回收量的影響見圖3。

圖3 微池頂空萃取溫度對萃取劑回收量的影響

注：萃取時間為20 min；萃取劑初始體積為50.0 μL。

隨著萃取溫度增加，除[C4MIM][BF4]離子液體回收量幾乎不變之外，其他3種揮發溶劑回收量迅速減小，當萃取溫度達50 ℃時，石油醚、正己烷和乙酸乙酯的剩余量分別為5，16，23 μL，當萃取溫度達60 ℃時，經過20 min的較長時間萃取，石油醚幾乎完全揮發，而正己烷和乙酸乙酯仍然分別有10.0 μL和3.0 μL的剩余量，能較好地滿足氣相色譜法或GC-MS法對進樣樣品用量的要求。

2.2 4種萃取劑的微池頂空萃取性能

萃取劑初始用量為50 μL，萃取時間為20 min和萃取溫度為45 ℃條件下，研究了正己烷、乙酸乙酯、石油醚和[C4MIM][BF4]離子液體4種萃取劑對香茅草揮發性風味的物質萃取性能，4種萃取劑微池頂空萃取物的GC-MS測定結果見圖4。

圖4 香茅草正己烷(a)、乙酸乙酯(b)、石油醚(c)和[C4MIM][BF4]離子液體(d)微池頂空萃取物的GC圖

由圖4可知，正己烷(22個峰)、乙酸乙酯(25個峰)、石油醚(21個峰)均比[C4MIM][BF4]離子液體(16個峰)獲得更多的色譜峰，具有更好的萃取效果。

4種萃取劑中檸檬烯、香茅醛、香茅醇、香葉醇、乙酸香茅酯、乙酸香葉酯和欖香烯7種香茅草特征風味物質測定色譜峰面積值見圖5。

圖5 室溫(20℃)下不同萃取劑中7種揮發性風味物質的色譜峰面積

注：溫度為20 ℃，萃取時間為10 min，萃取劑體積為50.0 μL。

由圖5可知，乙酸乙酯對7種特征風味物質具有較高的色譜峰面積，其次是石油醚和正己烷，[C4MIM][BF4]離子液體萃取性能最差，甚至不能檢測出香茅醇和香葉醇兩種重要風味物質，進一步說明乙酸乙酯對香茅草特征風味物質具有較好的萃取性能，因此，本文選擇乙酸乙酯作為頂空萃取劑進行后續實驗。

由上述實驗結果可知，本文基于微池頂空萃取裝置建立的微池頂空萃取法，萃取劑初始用量可達50.0 μL甚至更高，較單滴頂空微萃取法萃取劑用量5 μL增加10倍以上，即使揮發性較強的萃取劑，在經過較長時間頂空萃取后，仍然有足夠萃取劑剩余量供后續的GC或GC-MS等分析，相對于離子液體單滴頂空微萃取方法，微池頂空萃取法可選擇性能更為優良的揮發性頂空萃取劑，獲得更好的萃取效果，該且方法檢出靈敏度較單滴頂空微萃取方法有較明顯提高。

2.3 微池頂空條件優化

2.3.1 萃取溫度的影響

在萃取劑用量50.0 μL，萃取20.0 min條件下，研究萃取溫度對乙酸乙酯頂空萃取7種典型揮發性風味物質效率的影響，結果見圖6。

隨著溫度升高，揮發性風味物質色譜峰面積隨之增加，萃取溫度達到45 ℃時色譜峰面積達到最大，萃取溫度超過45 ℃后，色譜峰面積隨著溫度升高反而下降。可能是目標物質在萃取劑和氣相中的分配服從亨利定律，溫度增加，目標物質的分壓也隨之增加，導致其在溶劑中的溶解能力下降。其次，溫度過高也易導致頂空瓶內出現掛水珠的情況，部分目標物進入水珠中，從而影響萃取平衡。因此，本文確定其最佳萃取溫度為45 ℃。

圖6 萃取溫度對萃取效率的影響

注：萃取劑體積為50 μL，萃取時間為20 min。

2.3.2 萃取時間和萃取劑用量的影響

進一步研究萃取時間對萃取性能的影響，見圖7。

圖7 萃取時間對萃取效率影響

隨著萃取時間增加，各物質色譜峰面積也隨之增加，萃取時間達到15.0 min時各萃取峰面積接近最大，至20.0 min時趨于平緩，20.0 min后幾乎不變，本文確定的最佳萃取時間為20 min。

在萃取劑體積分別為20.0，30.0，40.0，50.0，60.0，70.0 μL時，研究萃取劑體積對萃取性能的影響，見圖8。

圖8 萃取劑體積對萃取效率的影響

各目標物質的色譜峰面積隨著萃取劑體積的增加而增加，當用量達到40.0 μL時色譜峰面積達最大，但萃取劑用量超過50.0 μL，色譜峰面積反而減少，可能是萃取劑用量過大的稀釋作用所致，且萃取劑體積過多達到反應平衡所需時間也隨之增長，因此，本文確定的萃取劑體積為40.0 μL。

2.4 香茅草揮發性風味物質微池頂空萃取GC-MS分析結果

本文采用微池頂空萃取法用乙酸乙酯作為萃取劑，初始體積為40.0 μL，樣品用量為1 g，在溫度為45 ℃下平衡15 min，通過GC-MS分析香茅草揮發性風味成分的種類及相對含量，并與[C4MIM][BF4]離子液體初始體積4.0 μL，單滴頂空微萃取進行比較，其結果見表1。

表1 不同萃取法萃取香茅草中揮發性成分及峰面積

由表1可知，乙酸乙酯微池頂空萃取共鑒定出25種香茅草揮發性風味成分，而單滴頂空微萃取僅萃取出13種，這表明本文提出的乙酸乙酯微池頂空萃取較單滴頂空微萃取具有更高的萃取效率。本研究獲得的香茅草主要揮發性成分相對含量最高的成分是香茅醛(20.35%)，其次依次為香茅醇(18.59%)、檸檬烯(16.60%)、香葉醇(14.13%)、欖香醇(7.34%)、α-欖香烯(4.33%)、乙酸香葉酯(2.78%)、乙酸香茅酯(2.73%)、桉葉油醇(1.99%)、γ-蓽澄茄烯(1.43%)、杜松醇(1.38%)、異胡薄荷醇(1.30%)、石竹烯(1.25%)、癸醛(1.00%)、2,6-二甲基-5-庚烯醛(0.99%)、芳樟醇(0.78%)、D-大根香葉烯(0.67%)、肉豆蔻酸(0.49%)、金合歡醇(0.51%)、甲基庚烯酮(0.34%)、α-依蘭油烯(0.29%)、甲酸香葉酯(0.23%)、4-甲基-1-(1-甲基乙基)-雙環[3,1,0]己二烯(0.23%)、角鯊烯(0.16%)、癸酸(0.14%)等。由結果可知，香茅草中的成分大多為醇類、酯類和烯類物質。香茅醛具有香茅、檸檬香氣；香葉醇具有溫和的玫瑰花香味；欖香醇帶有愉悅的花香，略帶辛辣的茴香氣味；香茅醇具有甜玫瑰香。這些物質構成了香茅草的清香風味。經與已有文獻對比，本法檢出香茅草中揮發性風味成分種類與CO2超臨界萃取法、水蒸氣蒸餾法、固相萃取法接近，再次證明了本法的可行性價值。此外，本法具有操作簡單、設備成本低廉、萃取效率高、選擇性強等優點。

3 結論

本文設計并制作了一種新型微池頂空萃取裝置，可明顯增加頂空萃取劑用量，有效解決了揮發性有機萃取劑在頂空過程中揮發穩定性差的問題，將揮發性有機溶劑乙酸乙酯用于香茅草揮發性風味物質的頂空萃取，建立了香茅草揮發性風味物質的乙酸乙酯微池頂空萃取氣相色譜-質譜聯用分析方法，相對于單滴頂空微萃取，可檢出更多的揮發性物質，主要揮發性風味物質檢出靈敏度明顯增加。相對于已有的超臨界CO2萃取法、頂空固相微萃取法、水蒸氣蒸餾法，本文提出的微池頂空萃取法在保證萃取效率的同時，具有簡單快速、分析成本低廉等明顯優點，適合于對食品中揮發性風味物質進行快速、高效的分析。