重慶地區CYP2C9和VKORC1基因多態性與華法令藥物敏感性的相關研究*

劉 玲，陳 敏，黃恒柳，何建維，杜金艷，唱 凱，皮 燕

(陸軍軍醫大學大坪醫院野戰外科研究所：1.檢驗科；2.神經內科，重慶 400042)

華法令是目前臨床廣泛使用的香豆素類口服抗凝藥物，主要應用于深靜脈血栓、肺栓塞、心房顫動、左心室血栓等疾病的治療[1]。路航等[2]對2014年房顫指南解讀中提及，據GLORIATM-AF登記的全球性研究數據顯示，中國患者華法令使用率最低，僅為20.3%，歐洲高達63.9%。大量國內外研究表明[3-6]，細胞色素P450超家族(CYP)中的CYP2C9，維生素K環氧化物還原酶復合體亞單位1(VKORC1)的基因多態性與華法令用藥劑量的個體差異密切相關。

目前研究表明，華法令治療窗窄，不同民族、個體間使用劑量存在明顯差異[7]。臨床上超劑量用藥有出血風險，而華法令用藥劑量不足將導致血栓形成。遺傳因素是影響華法令用藥的根本因素，而遺傳因素中影響華法令劑量及代謝最主要的是VKORC1、CYP2C9基因多態性，可解釋高達40%～60%華法令劑量個體差異[8-10]。本文就重慶地區人群CYP2C9和VKORC1基因多態性的分布進行研究，旨在為重慶地區華法令用藥提供依據。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2017年2月至2018年12月陸軍軍醫大學大坪醫院檢驗科檢測了CYP2C9和VKORC1基因多態性的患者657例，其中男357例，女300例，采用乙二胺四乙酸二鉀抗凝管采集外周血2～3 mL。所有患者為無血緣關系的重慶漢族人。

1.2儀器與試劑 血液基因組DNA提取試劑盒(購自中國北京天根有限公司)；CYP2C9、VKORC1基因多態性檢測試劑盒、生物芯片雜交儀、生物芯片識讀儀均購自中國上海百傲有限公司；PCR儀購自美國Bio-Rad公司。

1.3方法

1.3.1標本采集 乙二胺四乙酸二鉀抗凝管采集患者外周血2～3 mL，充分混勻，及時送分子室檢測。

1.3.2DNA提取 靜脈血按照全血DNA提取試劑盒說明書操作提取DNA。DNA樣品-20 ℃保存，反復凍融不超過3次。

1.3.3PCR擴增 取出提前分裝好的CYP2C9和VKORC1擴增液，擴增反應體系25 μL：CYP2C9和VKORC1擴增液22 μL、反應液1 μL、DNA模板2 μL。擴增條件：94 ℃預變性10 min；94 ℃ 30 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個循環；72 ℃ 5 min終止反應。擴增產物于2～8 ℃保存。

1.3.4雜交顯色 (1)雜交試劑準備：按照說明書配制雜交反應液、抗體使用液，加入試管架對應孔內。(2)CYP2C9和VKORC1基因芯片做好標記，放入雜交儀片架中。(3)雜交反應液中加入10 μL擴增產物，混勻，將試管架放入雜交儀，運行雜交程序。(4)取出芯片，放入生物芯片識讀儀中，用百傲基因芯片圖像分析軟件進行圖像掃描和數據分析，輸出檢測結果。

1.4統計學處理 用SPSS17.0統計軟件進行統計分析。用頻數計數法計算各基因型及等位基因頻率，用χ2檢驗比較基因型多態性在不同性別及疾病人群間的差異，P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結 果

2.1CYP2C9和VKORC1基因型檢測 CYP2C9和VKORC1擴增產物經基因芯片分析后的基因型生物芯片識別圖，見圖1。

注：A表示*1/*1 AA；B表示*1/*1 GA；C表示*1/*3 AA
圖1 CYP2C9和VKORC1基因芯片檢測結果

2.2CYP2C9和VKORC1基因型頻率及等位基因頻率 本研究中*1/*1型594例(90.41%)，*1/*2型3例(0.46%)，CYP2C9*1/*3型60例(9.13%)，其中*1等位基因頻率為95.21%，*2等位基因頻率為0.23%，*3等位基因頻率為4.56%。AA型542例(82.50%)，GA型112例(17.04%)，GG型3例(0.46%)，其中A等位基因頻率為91.02%，G等位基因頻率為8.98%。各基因型及等位基因分布在男女之間比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

2.3不同基因型人群的華法令使用劑量 本研究中檢測出8種基因型：*1/*1 AA型483例(73.52%)，*1/*1 GA型106例(16.13%)，*1/*1 GG型3例(0.46%)，*1/*2 AA型1例(0.15%)，*1/*2 GA型1例(0.15%)，*1/*3 AA型57例(8.68%)，*1/*3 GA型5例(0.76%)，*1/*3 GG型1例(0.15%)，未檢測出*1/*2 GG型。各基因型分布比較，差異無統計學意義(P>0.05)。其中需要使用高劑量華法令(5.0～7.0 mg)占16.59%，中等劑量(3.0～4.0 mg)占74.73%，低劑量(0.5～2.0 mg)占8.68%。見表2。

表1 CYP2C9和VKORC1基因多態性分布(n)

表2 不同CYP2C9和VKORC1基因型人群的分布及FDA推薦華法令使用劑量[n(%)]

注：a表示華法令高度敏感型，使用劑量為0.5～2.0 mg；b表示華法令敏感型,使用劑量為3.0～4.0 mg；c表示華法令不敏感型，使用劑量為5.0～7.0 mg

2.4CYP2C9和VKORC1各基因型分布在不同疾病患者間的比較 本研究收集冠心病患者376例、房顫患者117例、支架術后患者28例、靜脈血栓患者26例、其他心血管疾病患者93例、其他17例，其中冠心病患者最多。共檢測出8種基因型，其中*1/*1 AA型最多。各基因型分布在不同疾病患者間比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 不同疾病患者CYP2C9和VKORC1基因多態性比較(n)

3 討 論

華法令是由R-和S-對映體組成的外消旋混合物，起抗凝作用的主要是S-華法令，有研究表明，S-華法令抗凝作用比R-華法令高3～5倍[11]。細胞色素CYP2C9是一類主要存在于肝臟、腸道中的單加氧酶，華法令在肝臟中經CYP2C9代謝為非活性產物。CYP2C9基因位于染色體10q24.2，全長約55 kb[12]。目前已發現多種突變等位基因，其中以CYP2C9*2和CYP2C9*3突變型最為常見。CYP2C9基因突變導致酶活性降低，機體對華法令代謝減緩，華法令在體內堆積，出血風險增加，因此CYP2C9基因突變者華法令劑量應減少。VKORC1為維生素K循環中1個關鍵酶，可抑制依賴維生素K凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ活性，華法令通過抑制VKORC1發揮抗凝作用。VKORC1基因位于染色體16p11.2，全長約11 kb[12]。VKORC1存在基因多態性，尤其是-1639G>A，VKORC1基因突變后會導致酶活性降低，對華法令敏感程度增強，出血風險增加，故VKORC1基因突變者華法令使用劑量也應減少。

本研究結果顯示，重慶地區CYP2C9和VKORC1基因型以*1/*1型和AA型為主，頻率分別為90.41%、82.50%，這與文獻報道的中國漢族人群CYP2C9、VKORC1多態性一致[13]。CYP2C9基因突變在男女之間差異無統計學意義，這與文獻報道不一致[14]。本研究結果顯示，重慶地區使用高劑量華法令(5.0～7.0 mg)比例為16.59%，中等劑量(3.0～4.0 mg)比例為74.73%，低劑量(0.5～2.0 mg)比例為8.68%。隨著分子生物學的發展，個體化用藥已經成為了研究熱點，CYP2C9、VKORC1基因檢測開始受臨床醫生重視，但大多數醫生使用華法令抗凝依舊采用經驗劑量給藥，對本該需要使用高劑量華法令抗凝患者使用普通劑量華法令，抗凝效果減弱，甚至有出血風險。對華法令低劑量基因型患者使用普通劑量華法令，則可能導致抗凝過度，甚至出現血栓。研究表明，與未進行基因檢測患者相比，根據CYP2C9和VKORC1基因檢測結果用藥的患者出血及血栓發生風險降低29%，總住院率減少31%[15]。

4 結 論

重慶地區CYP2C9和VKORC1基因型以*1/*1 AA為主，人群以華法令敏感型為主，敏感型人群建議華法令起始劑量3.0～4.0 mg。華法令用藥前建議進行CYP2C9和VKORC1基因檢測從而提高華法令使用的安全性及有效性。