eCIM聯合mCIM試驗對肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶分型的應用*

尹 娟，朱超望，眭 陽，周莉靖，江 春，王瑩超

(南京醫科大學附屬蘇州醫院/蘇州市立醫院北區檢驗中心，江蘇蘇州 215008)

隨著碳青霉烯類抗菌藥物在臨床上的大量使用，耐碳青霉烯類藥物的革蘭陰性桿菌，如肺炎克雷伯菌(KPN)、粘質沙雷菌、鮑曼不動桿菌和銅綠假單胞菌等耐藥菌的檢出率逐年上升。其中產碳青霉烯酶的KPN在臨床樣本中的分離率位于前列[1]。腸桿菌科細菌對碳青霉烯類藥物耐藥機制分兩大類：產碳青霉烯酶和非產碳青霉烯酶，并以前者為主。按照Ambler分子分類方法可將碳青霉烯酶分為A、B、D三類。A類和D類為絲氨酸酶，B類為金屬酶。A類中的KPC，B類中的NDM、VIM、IMP和D類中的OXA-48是腸桿菌科細菌中最常見的碳青霉烯酶。碳青霉烯酶基因可通過質粒、轉座子或整合子等在同種菌或不同菌種間傳播，導致多種革蘭陰性桿菌對碳青霉烯類抗菌藥物耐藥，給臨床治療和醫院感染控制帶來極大挑戰[2-4]。因此，提高臨床微生物實驗室人員對耐碳青霉烯類細菌碳青霉烯酶的檢出率及分型的能力，有助于控制碳青霉烯酶基因在菌種間的傳播。

乙二胺四乙酸改良碳青霉烯滅活(eCIM)是2018年美國臨床和實驗室標準協會(CLSI)推薦的一種最新的可對腸桿菌科細菌碳青霉烯酶表型分型的方法[5]。eCIM與改良碳青霉烯滅活試驗(mCIM)聯合使用可區分產金屬酶和絲氨酸酶碳青霉烯酶的腸桿菌科細菌。與金標法PCR相比，這種方法不需購買特殊試劑和儀器設備，操作簡便，易于在臨床微生物實驗室推廣，可為臨床抗感染用藥提供重要參考。本研究以臨床微生物室分離的耐碳青霉烯類藥物的KPN為研究對象，擬探討在臨床應用實踐過程中，eCIM聯合mCIM試驗對KPN耐碳青霉烯酶的檢出率及分型準確率。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2016年9月至2018年1月蘇州市立醫院住院患者臨床樣本分離KPN非重復株684株，經BD Phoenix儀進行鑒定和藥敏試驗，選擇其中耐碳青霉烯類(亞胺培南和美羅培南)KPN 94株作為研究對象。質控標準菌株：KPN ATCCBAA 1705(KPC陽性，絲氨酸碳青霉烯酶產生株)，KPN ATCCBAA 1706(碳青霉烯酶陰性株)，KPN ATCCBAA 2146(NDM陽性，金屬酶產生株)。

1.2儀器與試劑 全自動微生物鑒定藥敏分析系統購自美國BD公司，型號Phoenix 100；MALDI-TOF MS質譜儀購自德國Bruker公司；金屬浴購自中國蘇州珀西瓦爾實驗設備有限公司，型號TZL-150-2C；低溫超速離心機購自美國貝克曼庫爾特公司，型號microfuge 22R centrifuge；PCR擴增儀購自美國Thermo公司，型號ARKTIK；核酸電泳儀購自美國Bio-Rad公司；凝膠成像分析系統購自中國上海天能科技有限公司，型號5200 multi；超低溫冰箱購自中國海爾公司。

哥倫比亞血平板、麥康凱平板、MH平板購自中國鄭州安圖生物公司；胰蛋白胨大豆肉湯購自法國科瑪嘉公司；亞胺培南和美羅培南藥敏紙片購自英國OXIOD公司，規格10 μg；Taq PCR Master Mix、瓊脂糖M、TAE緩沖液、4S Red Plus核酸染色劑、6×聚蔗糖凝膠上樣緩沖液Ⅲ均購自中國上海生工生物工程股份有限公司；所有引物由中國蘇州金唯智生物科技有限公司合成。

1.3方法

1.3.1細菌鑒定及藥物敏感試驗 標本分區劃線接種于血平板和麥康凱平板后，根據菌落形態特征分離KPN單菌落，使用BD Phoenix100全自動微生物鑒定藥敏分析系統進行菌種鑒定和藥物敏感試驗，結果參照CLSI 2018年版標準判讀。收集對亞胺培南和美羅培南耐藥的KPN，菌株鑒定經MALDI-TOF MS質譜儀確認，亞胺培南和美羅培南藥敏數據經K-B法確認。用含40%甘油的LB液體培養基保存KPN于-70 ℃超低溫冰箱。

1.3.2eCIM聯合mCIM對碳青霉烯酶進行分型試驗 mCIM試驗：取1.0 μL接種環滿環刮取血瓊脂平板上過夜培養純菌落，接種于2.0 mL胰蛋白胨大豆肉湯中，渦旋震蕩混勻10～15 s，每管放入1張含10 μg美羅培南的無菌紙片，確認紙片浸沒于菌懸液中，35 ℃培養箱孵育4 h。孵育結束時，用生理鹽水制備0.5麥氏濁度的大腸埃希菌ATCC 25922懸液；用10.0 μL接種環將美羅培南紙片從胰蛋白胨大豆肉湯中取出，將紙片貼于試管內壁，輕輕按壓以擠去紙片上多余水分，然后將紙片取出貼于已涂布有大腸埃希菌ATCC 25922的MH平板上。100 mm的MH平板貼4張紙片，倒置平板，35 ℃培養箱孵育18～24 h，量取抑菌圈直徑。

eCIM試驗：取第2支含2.0 mL胰蛋白胨大豆肉湯的小型離心管，管壁上標記細菌名稱。加入20.0 μL 0.5 μmol/L乙二胺四乙酸溶液于2.0 mL胰蛋白胨大豆肉湯中，乙二胺四乙酸最終濃度為5.0 mM，剩下步驟同mCIM試驗。mCIM和eCIM試驗同步進行，mCIM和eCIM試驗管中的美羅培南紙片貼于同1塊已涂布有大腸埃希菌ATCC 25922的MH平板上。

結果判讀的方法如下。mCIM試驗：抑菌圈直徑為6～15 mm或為16～18 mm但其內有散在菌落生長，為產碳青霉烯酶陽性菌株。抑菌圈直徑≥19 mm,為碳青霉烯酶陰性菌株。抑菌圈直徑在16～18 mm，不確定是否存在碳青霉烯酶。eCIM試驗：與mCIM結果相比，美羅培南抑菌圈直徑之差≥5 mm，為金屬酶陽性菌株。與mCIM結果相比，美羅培南抑菌圈直徑之差<4 mm，為金屬酶陰性菌株。當mCIM結果為陰性時，不解釋eCIM結果，因為碳青霉烯酶檢測為陰性。mCIM陽性，eCIM陽性，報告為金屬酶陽性。mCIM陽性，eCIM陰性，報告為絲氨酸酶碳青霉烯酶檢測陽性。

1.3.3菌株DNA提取 金屬浴裂解法提取細菌總DNA。取臨床分離保存于超低溫冰箱的菌株，室溫復蘇后平板劃線培養于血平板，35 ℃，5% CO2培養箱培養16 h。挑取單個菌落加入預先分裝有1 mL無菌蒸餾水的1.5 mL 小型離心管中，置于100 ℃金屬浴，高溫裂解15 min，12 000 r/min離心10 min，取上清液100.0 μL分裝凍存于-20 ℃冰箱備用。

1.3.4碳青霉烯酶基因PCR檢測 PCR法檢測5種碳青霉烯酶基因：KPC-2、OXA-48、IMP、NDM-1、VIM。反應體系為25.0 μL，包括2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL、上下游引物(10.0 μmol/L)各1.0 μL、DNA模板1.0 μL、ddH2O 9.5 μL。反應條件為94 ℃預變性4 min，94 ℃變性30 s,退火(KPC-2 59 ℃；OXA48 57 ℃；IMP 57 ℃；NDM1 60 ℃；VIM 57 ℃)30 s，72 ℃延伸(KPC-2 1 min；OXA48 45 s；IMP 2 s；NDM1 48 s；VIM 32 s)。產物經1 g/L瓊脂糖凝膠電泳后，用凝膠成像系統分析。PCR引物參照文獻[6-7]設計，見表1。

表1 碳青霉烯酶基因PCR引物序列

1.4統計學處理 運用SPSS軟件對eCIM聯合mCIM及PCR法對碳青霉烯酶分型及檢出率進行χ2分析，P>0.05表示二者結果一致，差異無統計學意義。

2 結 果

2.1eCIM聯合mCIM試驗檢測KPN碳青霉烯酶分型結果 94株試驗株中，mCIM試驗陰性7株(碳青霉烯酶陰性)，mCIM試驗陽性87株，eCIM陰性(絲氨酸酶表型)75株，eCIM陽性(金屬酶表型)12株，見圖1、表2。

2.2PCR檢測KPN碳青霉烯酶基因結果 75株eCIM陰性菌株中PCR檢測到絲氨酸酶基因KPC-2陽性75株。12株eCIM試驗陽性(金屬酶表型)菌株中PCR檢測到IMP基因陽性12株，未檢測到NDM-1和VIM基因，其中1例同時檢測到了KPC-2基因，即同時攜帶絲氨酸酶和金屬酶兩種基因。見圖2、表3。

表2 eCIM聯合mCIM試驗檢測KPN碳青霉烯酶分型結果(n)

圖1 eCIM聯合mCIM試驗碳青霉烯酶分型結果示例

表3 KPN碳青霉烯酶基因PCR檢測結果

注：*表示有1例IMP陽性菌株同時檢測到KPV-2陽性

2.3兩種方法對KPN碳青霉烯酶檢測的一致性分析 eCIM聯合mCIM試驗和PCR法對KPN碳青霉烯酶檢出率及分型，二者結果一致，差異無統計學意義(P>0.05)。見表4。

圖2 部分菌株KPC-2陽性和IMP陽性凝膠電泳圖

表4 兩種方法對KPN碳青霉烯酶檢出率的比較

3 討 論

近年來碳青霉烯類耐藥菌在臨床樣本中的分離率日益上升。有研究統計了2014-2015年，中國27個省市的KPN、大腸埃希菌碳青霉烯酶耐藥率分別為8%和2%，其中KPN占耐碳青霉烯類腸桿菌科的70%，位居首位，92%的KPN產碳青霉烯酶，主要基因型為KPC(63%)和NDM(34%)，有2%的菌株同時表達KPC和NDM[1]。碳青霉烯酶基因主要通過質粒傳播，給臨床抗感染治療及醫院感染控制帶來極大挑戰。

臨床微生物實驗室檢測碳青霉烯酶表型常見方法有改良Hodge試驗、Carba NP試驗和mCIM試驗等，但都無法對金屬酶和絲氨酸酶表型進行區分[8-12]。本文通過CLSI 2018版推薦eCIM聯合mCIM試驗檢測臨床KPN碳青霉烯酶并分型，結果與PCR法相比差異無統計學意義。eCIM聯合mCIM試驗可對絲氨酸酶和金屬酶兩種碳青霉烯酶類型進行快速分型，并不需特殊試劑和特定儀器設備，準確率高[13]。雖此法在檢測同時攜帶金屬酶和絲氨酸酶基因的菌株時，只能發現金屬酶表型，但在兩種基因同時攜帶流行的概率并不高的情況下，對碳青霉烯酶類耐藥腸桿菌(CRE)菌株篩查碳青霉烯酶并分型，按照CLSI 2018版的標準給臨床報告eCIM陽性(金屬酶)或陰性(絲氨酸酶)，可為臨床用藥提供重要參考依據。

臨床抗CRE感染治療常聯合使用多種抗菌藥物。碳青霉烯類藥物(亞胺培南、美羅培南等)的大量使用導致CRE菌株流行。頭孢他啶-阿維巴坦是2015年在美國被批準用于治療產KPC或OXA-48等絲氨酸酶菌株感染的復方藥物[14-15]。若臨床醫生根據實驗室結果，在對eCIM試驗陰性的CRE菌株的抗感染治療中及時選擇如頭孢他啶-阿維巴坦等對產絲氨酸酶菌株特異作用的藥物，精準用藥，可減少產碳青霉烯酶菌株的院內流行，控制感染，提高患者生存率。

4 結 論

eCIM聯合mCIM試驗檢測KPN中碳青霉烯酶分型，與PCR結果一致性高，不需購買特殊試劑，操作簡便，易于推廣，可為臨床抗感染用藥及醫院感染控制提供參考依據。