MALDI-TOF MS直接鑒定陽性厭氧血培養瓶中細菌的研究*

曹敬榮，王 巖，陳典典，段園園，閔 嶸，劉云屹，謝 威，王培昌

(首都醫科大學宣武醫院檢驗科，北京 100053)

血流感染是臨床上重癥感染性疾病之一，具有較高的發病率和病死率[1-2]。研究報道血培養陽性病原菌中絕大部分為兼性厭氧菌，專性厭氧菌的構成比為1%～17%[3]。由于厭氧血培養瓶內營養成分比需氧瓶好，資料顯示在血培養雙瓶報陽時厭氧瓶報陽時間(TTP)常早于需氧瓶，而且部分兼性厭氧菌只在厭氧血瓶內生長[3]。因此，早期、準確地鑒定陽性厭氧血培養瓶中細菌，提高兼性及專性厭氧菌的陽性檢出率，對臨床正確采取診療措施、降低治療費用、挽救患者生命等非常重要。基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(MALDI-TOF MS)已被報道用于直接鑒定血培養標本中的病原菌，為臨床微生物檢驗提供了一種省時、有效的手段，因而成為研究熱點[4-10]。本研究應用分離膠促凝管和0.5%十二烷基硫酸鈉(SDS)法聯合MALDI-TOF MS直接鑒定陽性厭氧血培養瓶中細菌，并與傳統陽性血培養鑒定方法比較，分析MALDI-TOF MS直接鑒定臨床厭氧血培養陽性菌的可行性和準確性，評價不同前處理方法用于質譜快速鑒定的臨床應用價值，為臨床早期、快速、準確診治血流感染提供依據。

1 材料和方法

1.1標本收集 收集2017年8月至2018年8月首都醫科大學宣武醫院微生物室非重復的陽性厭氧血培養瓶240瓶，經革蘭染色鏡檢有菌生長。剔除標準為血培養報警陽性后涂片鏡檢未見到可疑菌(假陽性)。

1.2試劑與儀器 全自動血培養系統及其配套的含溶血素厭氧血培養瓶，分離膠促凝管購自美國BD公司，型號FX400；甲酸、乙腈、三氟乙酸購自美國Sigma Aldrich公司；IVD細菌測試標準品、基質(HCCA)、96孔金屬靶板和Biotyper3.1鑒定分析軟件及質譜儀均購自德國Bruker公司；血瓊脂平板和厭氧血平板購自英國OXOID公司；SDS購自美國Sigma公司；厭氧產氣袋購自法國Biomerieux公司。

1.3方法

1.3.1陽性血培養涂片鏡檢及轉種后MALDI-TOF MS鑒定 血培養報陽后查看生長曲線和TTP，即刻完成對陽性培養液的染色鏡檢，初步確定血培養瓶中待測菌種類。同時轉種普通血平板和厭氧血平板(厭氧袋培養)，分別在需氧和厭氧環境37 ℃培養24～48 h至生長單個菌落。以1 μL加樣槍頭挑取單個菌落點靶，室溫干燥后加入70%甲酸1 μL，室溫干燥后加入1 μL基質溶液覆蓋，室溫晾干后將靶板放到質譜儀，應用Biotyper3.1軟件鑒定。質譜鑒定參數為線性、正離子、蛋白峰峰譜范圍2 000～20 000 m/z，激光解吸每孔240次。

1.3.2分離膠促凝管法和0.5% SDS法MALDI-TOF MS直接鑒定 將涂片鏡檢陽性的血培養瓶混勻后，根據文獻[7-10]中分離膠法和SDS法處理流程，富集獲得陽性厭氧血培養瓶中的細菌沉淀。分離膠法和SDS法前處理流程：用無菌注射器抽取陽性厭氧血培養瓶內溶液4 mL至分離膠促凝管或4 mL含0.5%SDS的離心管，室溫下4 000 r/min離心5 min棄上清。分離膠上層邊緣的灰白色沉淀或SDS離心后的沉淀中加入無菌水1 mL混勻后移至1.5 mL小型離心管，12 000 r/min離心2 min，棄上清，重復洗滌2次至清亮。沉淀加入300 μL無菌生理鹽水和900 μL無水乙醇混勻，12 000 r/min離心2 min后棄上清。加入50 μL 70%甲酸和50 μL乙腈混勻后13 000 r/min離心2 min，取上清(菌體蛋白)1 μL點靶，進行質譜鑒定。每1標本涂抹2個靶位，鑒定結果不一致時重復1次記錄結果。

1.3.3質譜鑒定評分標準 鑒定結果包括鑒定到種或屬、鑒定出兩種或兩種以上菌、頻譜錯誤、無鑒定結果、譜峰不足等情況。本研究參考文獻自建了MALDI-TOF MS鑒定結果判讀標準[10]：分值>2.0或1.7～2.0且均為同種菌記錄為種水平；分值1.7～2.0或≥1.6且有兩種以上菌記錄為屬水平；分值<1.6或存在多種不同菌記錄為無法準確鑒定。

2 結 果

2.1厭氧血培養的TTP 共收集陽性厭氧血培養瓶240瓶，患者年齡17～95歲，平均(60.11±17.93)歲，男性138例，女性102例；主要分布在急診科(24.17%，58/240)、普外ICU(16.67%，40/240)、普外科(7.92%，19/240)、神經內科(6.25%，15/240)和骨科病房(5.42%，13/240)。240瓶陽性厭氧血培養瓶包括單一菌陽性234瓶，混合菌生長6瓶，TTP為3.34～114.40 h，平均TTP為(16.87±13.12)h，其中革蘭陽性菌和革蘭陰性菌的平均TTP分別為(22.05±14.11)h和(14.00±11.43)h，混合菌的平均TTP為(12.42±1.69)h。

2.2分離膠促凝管法和0.5% SDS法MALDI-TOF MS鑒定結果 218瓶(90.83%)厭氧血培養瓶中細菌可用MALDI-TOF MS直接鑒定，4瓶(1.67%)混合菌生長無可靠鑒定結果。SDS法前處理鑒定的準確率(94.17%，226/240)高于分離膠法(90.83%，218/240)，兩種前處理方法對革蘭陰性菌的鑒定準確率(94.81%，146/154和94.16%，145/154)顯著高于革蘭陽性菌(87.5%，70/80和81.25%，65/80)，差異有統計學意義(χ2=3.96、9.53，P<0.05)；SDS法和分離膠法單一菌質譜鑒定與菌落鑒定結果的一致率分別為92.31%(216/234)和89.74%(210/234)。分離膠法和SDS法直接鑒定革蘭陰性桿菌和革蘭陽性菌的準確率差異無統計學意義(P>0.05)；分離膠法和SDS法均可鑒定厭氧菌(脆弱/多形擬桿菌，產氣莢膜梭菌等)。見表1。

表1 分離膠促凝管法和0.5% SDS法單一菌MALDI-TOF MS鑒定結果[n(%)]

2.3兩種前處理方法的鑒定分值 分離膠法和SDS法鑒定分值>2.0分者分別占65.81%和69.23%，1.6～2.0分者分別占23.93%和23.08%，<1.6分及錯誤鑒定者分別占10.26%和7.69%。SDS法鑒定革蘭陽性菌、革蘭陰性菌和厭氧菌得分>2.0的比率均高于分離膠法(62.50%，71.83%，83.33%；60.00%，69.72%，58.33%)；1.6～2.0分時分離膠法鑒定革蘭陰性菌和厭氧菌高于SDS法(23.94%，41.67%；22.54%，16.67%)。見表2。

2.4混合菌的鑒定 本研究共有6瓶陽性瓶為復合菌，分別為金黃色葡萄球菌+屎腸球菌、大腸埃希菌+屎腸球菌、弗勞地枸櫞酸桿菌+屎腸球菌、肺炎克雷伯菌+陰溝腸桿菌、肺炎克雷伯菌+糞腸球菌、肺炎克雷伯菌+乳酸乳球菌。其中，分離膠法鑒定出2瓶混合菌，3瓶僅檢出了其中一種菌，1瓶無可靠鑒定結果；SDS法鑒定出3瓶復數菌，3瓶僅鑒定出其中一種菌。見表3。

表2 分離膠促凝管法和0.5% SDS法單一菌MALDI-TOF MS鑒定分值[n(%)]

表3 分離膠促凝管法和0.5% SDS法MALDI-TOF MS鑒定混合菌結果

3 討 論

目前，國內外已有較多報道利用MALDI-TOF MS直接鑒定陽性血培養瓶中微生物的方法，富集菌的前處理方法包括分離膠促凝管法、皂素法、SDS法、預培養后鑒定商品化方法，各種方法均有各自特點和較好的鑒定結果[4-15]。亦有利用質譜技術進行厭氧菌鑒定的文獻報道和評估MALDI-TOF MS鑒定靈敏度的報道(可檢測100 CFU/mL)[16-18]。血流感染診治的關鍵是早期準確的病原學診斷，文獻報道厭氧血培養瓶的TTP多早于需氧瓶，且大部分血流感染病原菌為兼性厭氧菌，且厭氧菌引起血流感染有增加趨勢，但由于厭氧菌生長緩慢且生長條件苛刻，傳統的生化鑒定易出錯或鑒定率低，鑒定時間長，結果不可靠[3]。因此，快速鑒定陽性厭氧血瓶中微生物，對臨床早期的抗菌藥物治療有較大意義。而MALDI-TOF MS在快速鑒定病原菌方面體現了很大的優勢，能顯著縮短鑒定時間，本研究在涂片鏡檢確定有菌基礎上應用分離膠法和0.5%SDS前處理方法進行質譜的直接鑒定，并參照之前報道自建了質譜鑒定評分，分析MALDI-TOF MS直接鑒定臨床厭氧血培養陽性菌的可行性和準確性，為臨床對癥治療提供依據。

本研究共收集陽性厭氧血培養瓶240瓶，通過分析TTP可見，厭氧血培養瓶的TTP最短為3.34 h，最長為114.40 h，平均TTP為(16.87±13.12) h；革蘭陰性菌(14.00±11.43) h和混合菌(12.42±1.69)h的平均TTP明顯短于革蘭陽性菌(22.05±14.11)h，與文獻報道一致[1,3]。由此可見，利用質譜直接鑒定可顯著縮短報告時間，在報陽后2 h左右即可為臨床提供初步鑒定結果，為臨床及時抗感染治療爭取寶貴時間。本研究通過兩種不同預處理方法結合MALDI-TOF MS直接鑒定結果顯示分離膠法和SDS法與純培養鑒定的符合率差異無統計學意義，均可用于陽性厭氧瓶中微生物的直接鑒定。分離膠法和SDS法在鑒定革蘭陰性桿菌顯示了較高的準確率(>94%)，且對臨床常見革蘭陰性細菌可準確鑒定到種，顯示該兩種方法對于革蘭陰性菌引起的敗血癥有更高的可信度，臨床可根據血培養直接鑒定結果，結合本機構的耐藥性監測數據，及時給予患者針對性治療可大大減少危重患者的病死率。對厭氧菌的鑒定，兩種前處理方法均可鑒定，且SDS法的鑒定準確率(>2.0分)明顯高于分離膠法，提示采用0.5% SDS法對標本進行預處理，可達到更高的檢出率和更佳的鑒定結果，與文獻報道一致[7,10]。革蘭陽性菌的鑒定中SDS法(87.50%)前處理的檢出率略高于分離膠法(81.25%)，二者均可用于陽性血培養瓶的直接鑒定，對金黃色葡萄球菌的鑒定有較好結果(100.00%)，而鑒定其他葡萄球菌屬(表皮葡萄球菌、人葡萄球菌和溶血葡萄球菌等)的準確率相對較低，可能與其細胞壁中肽聚糖含量多而厚難以裂解出蛋白、以及某些殘留的血液蛋白可能干擾質譜峰有關；鑒定鏈球菌的準確率，SDS法較分離膠法鑒定率明顯增高(P<0.05)，但兩種前處理方法均未得到較好的鑒定結果(33%～66%)，可能與鏈球菌各菌種之間表型及蛋白相似性較高及質譜數據庫圖譜相對不足有關，與之前文獻報道相似，用純菌落鑒定有時亦難以區分(如肺炎鏈球菌、緩癥鏈球菌、口腔鏈球菌等)，需加做試驗進行確認[1,8,10]。另外，研究顯示質譜對混合感染樣本的直接檢測，有2瓶分別經SDS法和分離膠法處理后質譜直接鑒定(金黃色葡萄球菌+屎腸球菌和肺炎克雷伯菌+糞腸球菌)，分離膠法有3瓶僅檢出了其中一種菌，1瓶無確切鑒定結果，SDS法亦有3瓶僅檢出一種菌，與以往文獻的報道類似，可能與兩種菌在血培養瓶中的不同比例混合有關[7,19]。文獻認為多種菌不同比例混合時質譜能同時檢測到兩種菌(1∶1或1∶2)或只有優勢菌被檢出(1∶9比例混合)或無法準確鑒定(同一數量級的多種細菌可互相干擾質譜峰圖)[19]。本研究中復數菌的例數和混合菌種類型較少(6例)，還需更多的研究數據來證明或使用模擬標本來驗證。

4 結 論

本研究利用分離膠促凝管法和0.5% SDS前處理方法聯合MALDI-TOF MS鑒定陽性厭氧血培養瓶中的常見菌和厭氧菌，具有快速準確、成本低廉、可行性高的特點，是實驗室鑒定陽性血培養中病原菌的一個早期可行的檢測手段，SDS前處理法較分離膠法對厭氧菌的鑒定有更高的準確率，適合臨床微生物實驗室作為難鑒定或重癥患者快速鑒定的應用。