Six1和MTDH在人腦膠質瘤中的表達、臨床病理特征及預后的相關性分析

付 蘇，蔣 艷，樊朝鳳，段麗娟

(四川大學華西醫院，四川成都 610041)

人腦膠質瘤是臨床上較為嚴重的疾病，其惡性程度較高，術后易復發，預后較差。全球每年約有18.9萬新發患者，并有14.2萬患者死亡，嚴重影響人類的健康[1-2]。為了改善患者預后，提高生存率，盡早診斷并給予有效治療就顯得尤為重要。因此，探索更多與患者臨床病理特征及預后相關的生物標志物具有重要的臨床意義。有研究結果顯示，Six1在宮頸癌組織中表達上調，能夠促進惡性腫瘤的發生、發展[3]。Six1蛋白是屬于Six同源盒基因家族的成員之一，作為轉錄因子，不僅能夠參與胚胎細胞的發育，還能夠調節癌細胞的啟動與轉移[4]。有研究表明，異黏蛋白(MTDH)在直腸癌組織中表達高于正常，并與腫瘤的分化、轉移密切相關[5]。MTDH屬于星型細胞上調基因-1的表達產物，是一種胞質蛋白，主要分布核周胞質，近年發現MTDH與多種腫瘤的形成、侵蝕、發展密切相關[6-7]。目前，人腦膠質瘤的形成與發展仍需進一步研究。因此，本次研究主要是采用免疫組化法檢測150例人腦膠質瘤中Six1、MTDH的表達與臨床病理特征及預后的相關性。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取本院2012年12月至2016年12月收治的150例腦膠質瘤患者作為研究對象，并根據病理檢查與臨床資料將150例膠質瘤組織作為研究組，同時選擇60例非腫瘤腦組織作為對照組。研究組男性78例，女性72例，年齡10～71歲，平均(52.21±5.50)歲。對照組男性32例，女性28例，年齡11～72歲，平均(53.22±5.47)歲。2組患者的年齡、性別等一般資料比較差異無統計學意義(P>0.05)；并按照2007世界衛生組織神經系統腫瘤分級標準診斷[8]分為Ⅰ級45例、Ⅱ級40例、Ⅲ級33例、Ⅳ級32例。納入標準：(1)符合膠質瘤的診斷標準[9]；(2)無肥胖以及糖尿病代謝者；(3)獲得患者及家屬的知情同意，并簽署知情同意書；(4)術后早期復查，已證實腫瘤全切或次全切；(5)術前未進行放療、化療治療者。排除標準：(1)合并其他惡性腫瘤、嚴重器官疾病者；(2)嚴重肝腎功能不全、血液系統疾病者；(3)術后再次手術、未順從隨訪者；(4)既往精神病史者。本次研究已獲得醫學倫理委員會批準。

1.2方法

1.2.1儀器與試劑 兔抗人Six1單克隆抗體購自美國Sigma公司；鼠抗人MTDH單克隆抗體購自美國Abnova公司；免疫組化試劑盒和DAB顯色試劑盒購自中國福州邁新生物技術有限公司。

1.2.2采用免疫組化法檢測Six1、MTDH蛋白表達 采用免疫組化法進行免疫組織化學染色，使用10%福爾馬林將標本常規固定，石蠟包埋，切片后進行脫水，使用3%過氧化氫阻斷內源性過氧化物酶時間30 min，再使用乙二胺四乙酸高壓抗原修復，封閉30 min，加入稀釋濃度為1∶500的一抗，4 ℃孵育過夜。再分別加入二抗，孵育25 min，最后使用DAB顯色試劑盒顯色，蘇木素復染，鹽酸乙醇分化，自來水返藍，蒸餾水洗滌，脫水、透明封片。用磷酸鹽緩沖液代替一抗作為空白組對照。

1.2.3結果判定[10]每張切片隨機選取5個高倍鏡視野，并根據細胞染色強度與陽性細胞百分比進行判斷，采用染色指數反映目的蛋白的表達水平。(1)根據陽性細胞染色強度：無著色為0分；黃色為1分；棕色為2分；棕褐色為3分。(2)根據陽性細胞百分比：<5%為0分、5%～25%為1分、26%～50%為2分、51%～75%為3分、>75%為4分。(3)染色指數=將陽性細胞百分比例與著色強度評分相乘判斷結果，具體標準為：0分為陰性表達(-)，≥1分均為陽性表達，1～2分為低表達(+)，3～4分為中表達(++)，6～9分為高表達(+++)。免疫結果由高年資的病理醫師共同完成。

1.3隨訪 采用電話或者上門進行隨訪，隨訪時間為確定病理日開始至2018年12月30日截止，每3個月隨訪一次，隨訪時間為3-72個月，以患者發生轉移或死亡為終點。

2 結 果

2.12組Six1、MTDH蛋白表達水平比較 研究組Six1、MTDH蛋白陽性表達率分別為65.33%(98/150)、63.33%(95/150)，對照組Six1、MTDH蛋白陽性表達率分別為33.33%(20/60)、28.33%(17/60)，2組比較差異有統計學意義(P<0.05)。見表1、圖1。

2.2腦膠質瘤Six1、MTDH蛋白表達和臨床病理特征的比較 Six1、MTDH蛋白表達在腦膠質瘤患者的年齡、性別、病理類型、病理學分級以及腫瘤直徑之間差異無統計學意義(P>0.05)，但與腦膠質瘤患者的分化程度差異有統計學意義(P<0.05)，并且當腫瘤分化程度越低時，Six1、MTDH蛋白陽性表達率越高(P<0.05)。見表2。

2.3腦膠質瘤中Six1、MTDH蛋白表達的相關性 采用Spearman等級相關分析法分析蛋白表達的相關性，結果顯示在腦膠質瘤患者中Six1、MTDH蛋白表達呈正相關(r=0.354，P<0.05)。

表1 2組腦膠質瘤Six1、MTDH蛋白表達水平比較[n(%)]

表2 腦膠質瘤患者Six1、MTDH蛋白表達與臨床病理特征的比較

2.4腦膠質瘤患者的預后生存情況 所有研究對象在病理確診開始至隨訪結束存活3-72個月。腦膠質瘤患者平均中位生存期36個月，其中Six1陽性表達和陰性表達患者的中位生存期分別為21個月、44個月，中位生存期比較差異有統計學意義(χ2=22.872，P<0.05)；MTDH陽性表達和陰性表達患者的中位生存期分別為19個月、45個月，中位生存期比較差異有統計學意義(χ2=24.361，P<0.05)。見圖2、3。

2.5影響腦膠質瘤患者預后的單因素分析 經單因素分析得出：病理學分級越高、腫瘤低分化、Six1陽性、MTDH陽性表達的患者其生存時間均明顯縮短(P<0.05)。見表3。

注：A表示Six1在非腫瘤腦組織中陰性表達；B表示MTDH在非腫瘤腦組織中陰性表達；C表示Six1在腦膠質瘤組織中弱表達；D表示MTDH在腦膠質瘤組織中弱表達；E表示Six1在腦膠質瘤組織中高表達；F表示MTDH在腦膠質瘤組織中高表達
圖1免疫組化染色檢測Six1和MTDH在人腦膠質瘤中的表達(×400)

圖2 不同Six1表達水平腦膠質瘤患者生存曲線比較

2.6影響腦膠質瘤患者預后Cox多因素分析 經多因素Cox比例風險回歸模型分析得出：腫瘤低分化、Six1陽性、MTDH陽性表達均為影響腦膠質瘤患者預后的獨立危險因素(P<0.05)。見表4。

圖3 不同MTDH表達水平腦膠質瘤患者生存曲線比較

表3 影響腦膠質瘤患者預后的單因素分析

表4 影響腦膠質瘤患者預后Cox多因素分析

3 討 論

人腦膠質瘤是臨床上常見的中樞神經系統疾病，有較高的致死率，預后較差。目前臨床上對于人腦膠質瘤主要采取手術聯合放療及化療等綜合治療方式，雖能夠改善患者臨床癥狀，但預后效果仍無法得到保障。但有研究發現，人腦膠質瘤中的蛋白表達能夠反應出腫瘤嚴重程度[11]。既往研究發現，Six1在多種腫瘤中的表達水平升高，且與腫瘤的發展及預后有著重要關系[12]。廖粵軍等[13]通過研究MTDH在腫瘤中的表達，并發現MTDH隨著腫瘤逐漸嚴重其表達水平呈現高表達狀態。說明MTDH在腫瘤的發生與發展中具有重要意義。本次研究運用免疫組織化學染色法檢測150例人腦膠質瘤的表達以及不同病理特征以及預后的相關性。

結果顯示，Six1、MTDH蛋白陽性表達率在人腦膠質瘤組織中明顯升高，并與腦膠質瘤的分化程度顯著相關(P<0.05)，且隨著腫瘤分化程度逐漸嚴重，Six1、MTDH陽性表達率越高(P<0.05)，表明Six1、MTDH表達與腫瘤等級呈正相關，能夠反應疾病的嚴重程度。本次研究運用Spearman等級相關分析法，結果顯示腦膠質瘤患者中Six1、MTDH蛋白表達呈正相關(r=0.354，P<0.05)，由此可見，Six1、MTDH具有較強的相關性。在人腦膠質瘤中Six1、MTDH陽性表達的中位生存時間均縮短，并與腫瘤的分化程度密切相關。為了進一步證實，本次研究還運用了Cox比例風險回歸模型，結果顯示，腫瘤低分化、Six1、MTDH陽性表達均為影響腦膠質瘤患者預后的獨立危險因素(P<0.05)，表示Six1、MTDH表達能夠反應人腦膠質瘤的嚴重程度，可作為評估患者預后的有效指標。

Six家族主要是由Six1/Six2、Six3/Six6、Six4/Six5亞家族組成[14]。其中Six1作為同源盒基因成員之一，產物蛋白是由高度保守的同源異型結構域的N-末端以及Six結構域組成[15]，基因主要定位于人染色體14q23上，能夠特異性的調節基因的表達，不僅能夠影響組織細胞的發育，同時對細胞的增殖、分化、凋亡以及遷移等方面均有著重要的作用[16]。同時近來研究發現，Six蛋白在多種腫瘤中表達上調，能夠誘導腫瘤細胞增殖、侵蝕以及轉移，對于腫瘤的發生、發展有著重要的意義[17]。MTDH屬于星型細胞上調基因-1的表達產物，是一種極其保守的蛋白，其蛋白基因主要定位于8q22上，并具有多個轉錄子，其跨膜區在432至451氨基酸以及561至580氨基酸之間，存在與核定位信號相關的賴氨酸[18-19]。并發現MTDH與多種腫瘤的發展、增殖、侵蝕、轉移相關[20]。但本組研究選取樣本量較少和研究時間過短，更多研究結果，需進一步深入研究。

4 結 論

Six1蛋白與MTDH蛋白在腦膠質瘤患者組織中的表達水平升高，其表達水平隨著腦膠質瘤惡性程度的升高而升高，Six1蛋白表達陽性或MTDH蛋白表達陽性患者預后較差，生存時間明顯縮短。Six1蛋白與MTDH蛋白可作為判斷腦膠質瘤患者預后的生物標志物。