響應面法優化超聲輔助提取柿皮類胡蘿卜素及其體外抗氧化性研究

米雪，劉樹興，曾橋,2,3*，徐丹

(1.陜西科技大學 食品與生物工程學院，西安 710021；2.陜西科技大學 輕工科學與工程學院，西安 710021；3.陜西農產品加工技術研究院，西安 710021)

柿子樹為柿科柿屬落葉大喬木，生長在熱帶和溫帶地區。我國是柿子樹的主要種植區，柿子年產量占全世界的50%以上[1]，主要分布于陜西、山東、河南等地。柿子營養豐富，產量巨大，有數據表明，2016年我國柿子產量達396萬噸。柿子成熟后不易長期保存，除鮮食外，大部分被進一步深加工制成柿餅、柿干、濃縮柿子汁等。柿皮是柿子深加工過程中的主要副產物，約占柿子重量的10%[2]，近年來，隨著柿子產業的快速發展，因大量的柿皮未被有效地處理而對環境造成了較為嚴重的污染，越來越被大家重視。研究表明，柿皮中含有較多的多酚、膳食纖維、果膠物質、單寧以及類胡蘿卜素等活性成分[3-5]，具有進一步開發的潛力。綜合利用柿子皮，不僅可以提高柿子加工產品的附加值，而且可以實現柿子加工副產物的減量化和資源化，對于環境保護具有重要意義。

類胡蘿卜素是一系列化合物，是比較常見的自然色素的合稱[6]，為脂溶性色素，呈黃色、橙色和紅色[7]，只能由植物和微生物合成。研究表明，類胡蘿卜素的抗氧化和抗炎活性較好，具有增強免疫力[8]、抗癌、預防心血管疾病、保護視覺和防止老年性黃斑變性等功能[9]，是一種極具發展前途的功能性天然色素，可作為抗氧化劑、著色劑、膳食補充劑等用于食品和調味品中[10]。而柿皮中類胡蘿卜素含量較為豐富，為了充分利用這一資源，本文對柿皮中類胡蘿卜素的提取工藝和抗氧化活性進行了研究，從而為我國豐富的柿皮資源化利用提供了理論依據，以期促進柿子產業的發展。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

柿皮：由富平永輝現代農業柿子產業園提供。

β-胡蘿卜素標準品、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、ABTS二胺鹽：上海源葉生物科技有限公司；碳酸氫二鈉、石油醚、碳酸二氫鈉、鐵氰化鉀、乙酸乙酯、抗壞血酸、無水乙醇、30%雙氧水、三氯化鐵：天津科密歐化學試劑有限公司；丙酮、水楊酸：國藥集團化學試劑有限公司；以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

FA1004N型電子分析天平 上海上天精密儀器有限公司；UV-1100型紫外可見分光光度計 上海美譜達儀器有限公司；600型電熱恒溫水浴鍋 北京科偉永興儀器有限公司；RE52CS-1型旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器廠；KH5200DE型超聲波清洗器 昆山禾創超聲儀器有限公司；GZX-9246MBE型電熱鼓風干燥箱 上海博迅實業有限公司醫療設備廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 原料預處理

將新鮮柿皮冷凍干燥，取出切成小塊，粉碎過20目篩，備用。

1.3.2 β-類胡蘿卜素標準曲線的繪制

精確稱取β-胡蘿卜素標準品5 mg，溶解于丙酮中，定容至100 mL，制備成濃度為50 μg/mL的β-胡蘿卜素標準液。分別吸取5，10，15，20，25 mL標準液至50 mL容量瓶中，用丙酮定容，制備成濃度分別為5，10，15，20，25 μg/mL的標準工作液，在450 nm處測量吸光值，并繪制標準曲線。得回歸方程為Y=0.0227X+0.0048，R2=0.9996，線性關系良好。

1.3.3 類胡蘿卜素的提取

精確稱取柿子皮粉1 g，置于100 mL具塞三角瓶中，固定超聲功率為100 W，按一定液料比加入提取溶劑，在一定溫度下超聲輔助提取一定時間后，抽濾得柿皮類胡蘿卜素粗提液，定容，稀釋至一定倍數，在450 nm處測得吸光度值，進行3組平行試驗，按(1)式計算類胡蘿卜素含量。

(1)

式中：C為類胡蘿卜素的濃度，μg/mL；V為溶液體積，mL；N為稀釋倍數；m為樣品質量，g。

1.3.4 單因素試驗設計

提取溶劑的選擇：固定液料比為20∶1 (mL/g)，提取溫度為50 ℃，超聲輔助提取40 min，分別考察丙酮、無水乙醇、乙酸乙酯、石油醚作為提取溶劑對類胡蘿卜素提取率的影響。超聲溫度的選擇：用無水乙醇作為提取溶劑，固定液料比為20∶1 (mL/g)，超聲輔助提取40 min，分別考察提取溫度為30，40，50，60，70 ℃時對類胡蘿卜素提取率的影響。超聲時間的選擇：以無水乙醇作為提取溶劑，固定液料比為20∶1 (mL/g)，溫度為50 ℃，分別考察超聲提取時間為10，20，30，40，50 min時對類胡蘿卜素提取率的影響。液料比的選擇：以無水乙醇作為提取溶劑，固定超聲提取溫度為50 ℃，提取時間為40 min，分別考察液料比為15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1、40∶1 (mL/g)時對類胡蘿卜素提取率的影響。

1.3.5 響應面試驗設計

在單因素試驗基礎上，固定提取溶劑為無水乙醇，超聲功率為100 W，選擇超聲溫度、超聲時間和液料比3個因素，采用Design Expert 8.0.6軟件進行三因素三水平的Box-Behnken中心組合試驗設計，因素和水平設計見表1。

表1 Box-Behnken試驗設計因素和水平表

1.3.6 柿皮中類胡蘿卜素抗氧化活性評價

1.3.6.1 DPPH自由基清除活性測定[11]

精確稱取DPPH粉末5.0 mg，以無水乙醇為溶劑配制成0.05 mg/mL的DPPH對照溶液。于試管中依次加入質量濃度分別為5，10，20，30，40，50 μg/mL的柿皮類胡蘿卜素溶液2.00 mL和DPPH溶液2.00 mL，震蕩均勻后在28 ℃下水浴30 min。以無水乙醇調零，于517 nm處測定吸光度，記為A樣品，用無水乙醇代替DPPH溶液按以上方法測定吸光度，記為A對照，用無水乙醇代替柿皮類胡蘿卜素提取液按以上方法測定吸光度，記為A空白。DPPH 自由基清除率計算公式如下：

(2)

1.3.6.2 ·OH清除活性測定[12]

于試管中依次加入6 mmol/L的FeSO4溶液2 mL，2 mL質量濃度分別為5，10，20，30，40，50 μg/mL的柿皮類胡蘿卜素提取液，2 mL濃度為6 mmol/L的H2O2溶液，震蕩均勻，靜置10 min，加入2 mL濃度為6 mmol/L的水楊酸溶液并搖勻，靜置30 min，以蒸餾水調零，于510 nm 處測定各梯度濃度下溶液的吸光度，記為A樣品，按上述方法用蒸餾水代替柿皮類胡蘿卜素提取液測定吸光度，記為A空白，用蒸餾水代替水楊酸按上述方法測定吸光度，記為A對照，并按公式(3)計算·OH清除率，同時，以Vc作為陽性對照。

(3)

1.3.6.3 ABTS+清除活性測定[13]

于試管中依次加入質量濃度為5，10，20，30，40，50 μg/mL柿皮類胡蘿卜素提取液0.5 mL，含ABTS+的溶液4.0 mL，靜置6 min。以無水乙醇調零，在734 nm處測定吸光度A樣品；用無水乙醇代替柿皮類胡蘿卜素提取液按以上方法測定吸光度A空白；Vc作為陽性對照。按下式計算ABTS+清除率：

(4)

1.3.6.4 還原力測定[14]

取質量濃度分別為5，10，20，30，40，50 μg/mL的柿皮類胡蘿卜素提取液0.5 mL，依次加入0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液和1%鐵氰化鉀溶液各2.5 mL，搖勻后置于50 ℃水浴中反應20 min，進一步加入10%三氯乙酸溶液2.5 mL、蒸餾水5 mL和0.1%氯化鐵溶液1 mL ，震蕩均勻后靜置10 min，以無水乙醇代替柿皮類胡蘿卜素提取液作空白對照，于700 nm波長處測定吸光度。

1.3.7 數據分析方法

本文所有試驗均設置3次重復，數據為重復試驗的平均值。響應面優化試驗數據用Design-Expert 8.0.6軟件進行二次回歸分析及方差分析，其他試驗結果均采用Origin 8.0軟件進行處理。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果與分析

2.1.1 提取溶劑對柿皮類胡蘿卜素提取的影響

類胡蘿卜素具有疏水性，常使用有機溶劑進行提取，常見的包括丙酮、氯仿、甲醇、乙醇、乙醚和己烷等，其中以丙酮和乙醇較佳[15]。

圖1 提取溶劑對柿皮類胡蘿卜素提取的影響

由圖1可知，不同提取溶劑對類胡蘿卜素提取效果的影響較為明顯，以無水乙醇作提取溶劑時，柿皮類胡蘿卜素含量最高；當乙酸乙酯作為提取溶劑時，柿皮類胡蘿卜素含量最低。這是因為類胡蘿卜素在不同的溶劑中具有不同的溶解度，因此提取效果也各不相同。無水乙醇作為常用溶劑，具有安全、成本低、粘性小、易回收等優點。因此，合適的提取溶劑為無水乙醇。

2.1.2 超聲溫度對柿皮類胡蘿卜素提取的影響

圖2 超聲溫度對柿皮類胡蘿卜素提取的影響

由圖2可知，溫度逐漸升高，柿皮類胡蘿卜素含量先增加后減小。當溫度升高至50 ℃時，類胡蘿卜素含量達到最大。溫度越高，分子熱運動越快，類胡蘿卜素溶解速率越快，但溫度過高，含量下降，這可能是由類胡蘿卜素的不穩定性引起的，導致類胡蘿卜素活性喪失，乙醇的蒸發速率增加且能量消耗增加。綜合考慮，選取的超聲溫度為50 ℃，隨后的響應面優化試驗在40～60 ℃范圍內進行。

2.1.3 超聲時間對柿皮類胡蘿卜素提取的影響

圖3 超聲時間對柿皮類胡蘿卜素提取的影響

由圖3可知，柿皮類胡蘿卜素的含量隨超聲時間的增加而逐漸增加，在40 min達到最大值。進一步延長提取時間，類胡蘿卜素含量反而下降，這可能是由于較長時間超聲波作用過程破壞了類胡蘿卜素[16]。因此，最佳超聲時間為40 min，后續響應面優化試驗在30～50 min范圍內進行。

2.1.4 液料比對柿皮類胡蘿卜素提取的影響

圖4 液料比對柿皮類胡蘿卜素提取的影響

由圖4可知，柿皮類胡蘿卜素含量隨液料比的增加先增大后減小，在液料比30∶1 (mL/g)時，含量達到最大值，隨后呈現下降趨勢。因此，較佳液料比為30∶1 (mL/g)，后續響應面試驗在液料比20∶1～40∶1 (mL/g)范圍內進行。

2.2 柿皮類胡蘿卜素提取工藝的優化

2.2.1 Box-Behnken中心組合試驗設計及結果

選取超聲溫度(A)、超聲時間(B)、液料比(C)進行三因素三水平共17組Box-Behnken響應面分析實驗。方案設計及結果見表2。

表2 Box-Behnken中心組合設計實驗及結果

續 表

2.2.2 回歸模型的建立及顯著性分析

利用Design Expert 8.0.6軟件對柿皮類胡蘿卜素提取試驗結果進行多元回歸擬合，得到以柿皮類胡蘿卜素含量為目標函數的二次回歸方程：

Y=-2.41+0.099A+0.073B+0.040C-8.555×10-4AB+2.075×10-5AC+2.900×10-5BC-5.627×10-4A2-3.800×10-4B2-5.237×10-4C2。

表3 響應面數據分析表

注：“*”表示差異顯著，P<0.05；“**”表示差異高度顯著，P<0.01；“***”表示差異極顯著,P<0.001。

由表3可知，模型的P值<0.001，表示回歸方程極顯著，失擬項P值為0.3311，不顯著，說明該模型能夠很好地擬合試驗數據。回歸方程決定系數R2=0.9603，調整決定系數RAdj2=0.9094，表明回歸方程具有較好的擬合度。超聲溫度(A)、超聲時間(B)、液料比(C)的一次項均達到了顯著水平。影響因素由大到小順序為：超聲溫度>超聲時間>液料比。此外，超聲溫度(A)和超聲時間(B)的交互作用、超聲溫度(A)、液料比(C)的二次項也達到了顯著水平。

2.2.3 響應面優化分析

響應面曲面圖和等高線圖由Design Expert 8.0.6軟件繪制，各因素交互作用的響應曲面圖和等高線圖見圖5。

圖5 各因素交互作用對類胡蘿卜素提取含量影響的響應面和等高線圖

經Design Expert軟件優化，響應面優化模型預測柿皮類胡蘿卜素最佳工藝條件為：超聲溫度60 ℃，超聲時間30.29 min，液料比39.75∶1 (mL/g)，理論計算柿皮類胡蘿卜素提取的最大含量為2.63 mg/g，考慮到實際操作的可行性和方便性，將最佳工藝參數調整為超聲溫度60 ℃，超聲時間30 min，液料比40∶1 (mL/g)，在此條件下，進行平行3次驗證試驗，實測含量為2.58 mg/g，與預測值誤差為1.9%，說明該模型對柿皮類胡蘿卜素提取工藝的優化具有一定的實際應用價值。

2.3 柿皮類胡蘿卜素體外抗氧化活性評價

2.3.1 對DPPH自由基的清除作用

圖6 柿皮類胡蘿卜素對DPPH自由基清除作用

由圖6可知，隨著濃度的增加，柿皮類胡蘿卜素和Vc對DPPH自由基的清除率增加，當柿皮類胡蘿卜素質量濃度大于20 μg/mL時，其對DPPH自由基的清除效果略高于Vc，且進一步提高柿皮類胡蘿卜素的濃度，其清除能力增加緩慢，當柿皮類胡蘿卜素質量濃度為50 μg/mL時，其對DPPH自由基的清除率可達96.5%，與同濃度下Vc的清除能力相當，說明柿皮類胡蘿卜素清除DPPH自由基的能力較強。

2.3.2 對·OH的清除作用

圖7 柿皮類胡蘿卜素對·OH清除作用

由圖7可知，對·OH的清除率隨著柿皮類胡蘿卜素和Vc濃度的增加而增加，當質量濃度達到50 μg/mL時，柿皮類胡蘿卜素相較于Vc具有更好的清除能力，柿皮類胡蘿卜素對·OH的清除率為46.5%，而Vc僅為32%，且類胡蘿卜素對·OH的清除能力仍呈明顯上升趨勢，而Vc則較為緩慢。

2.3.3 對ABTS+的清除作用

圖8 柿皮類胡蘿卜素對ABTS+清除作用

由圖8可知，隨著柿皮類胡蘿卜素和Vc質量濃度的增加，ABTS+清除率增加，當柿皮類胡蘿卜素質量濃度為50 μg/mL時，其對ABTS+的清除率達93.4%，和相同濃度下的Vc清除能力相當。結果表明，柿皮類胡蘿卜素清除ABTS+的能力較強。

2.3.4 還原力

圖9 不同質量濃度柿皮類胡蘿卜素還原力

由圖9可知，柿皮類胡蘿卜素和Vc的還原力隨著質量濃度的增加而增加，柿皮類胡蘿卜素的還原力明顯強于Vc，當柿皮類胡蘿卜素質量濃度為50 μg/mL時，吸光度為0.40，相同濃度下Vc的吸光度僅為0.17。

3 結論

響應面優化出柿皮中類胡蘿卜素的最佳提取工藝為：超聲功率100 W，提取溶劑為無水乙醇，提取溫度60 ℃，提取時間30 min，液料比40∶1 (mL/g)，進行驗證試驗，測得含量為2.58 mg/g，與理論計算柿皮中類胡蘿卜素的最大提取含量2.63 mg/g比較，誤差僅為1.9%，具有實用價值。體外抗氧化試驗結果表明，當柿皮類胡蘿卜素濃度為50 μg/mL時，DPPH自由基的清除率為96.48%，略高于Vc；對ABTS+的清除率達93.35%，與Vc相當；50 μg/mL柿皮類胡蘿卜素對·OH的清除率達46.54%，顯著高于Vc；50 μg/mL柿皮類胡蘿卜素對鐵的還原力為0.40，顯著高于Vc，說明柿皮類胡蘿卜素具有較強的體外抗氧化活性。