超聲波對發酵白菜亞硝酸鹽含量的影響

燕平梅,李潤花,趙文婧,陳燕飛

(1.太原師范學院 生物系,太原 030619; 2.土壤消毒活化綠色產業技術創新戰略聯盟，太原 030619)

發酵蔬菜在我國歷史悠久，是經乳酸發酵制成的蔬菜腌漬品，因其易保藏、成本低、風味多樣而備受人們的喜愛。泡菜中的主要發酵微生物是乳酸菌，對一些致病菌具有強烈的抵抗作用，可吸收白菜中的碳水化合物，并釋放出酒精和二氧化碳，有效地抑制對腸道產生不利影響的腐敗菌和致病菌[1-3]，減弱了有害菌對人體代謝的傷害，此外，還有幫助腸道消化，避免膽固醇含量過高等一系列對人體有益的醫療功效[4]。但亞硝酸鹽總是不可避免地在泡菜制備過程中產生，若其含量超過一定值，輕者對人體造成輕微損害，重者危害生命。大部分人們食用的亞硝酸鹽來源于蔬菜[5-8]，但由于在發酵過程的開始階段硝酸鹽還原菌活躍，能產生硝酸鹽還原酶使硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，因此發酵食品中亞硝酸鹽含量比一般食品要高得多。亞硝酸鹽能使高鐵血紅蛋白含量升高，導致氧無法被運輸到體內需氧的部位[9-11]，體內氧循環不能正常進行，阻滯人體代謝造成全身發紫。

為降低發酵食品中的亞硝酸鹽含量，降低食用泡菜給人體帶來的傷害，本實驗使用超聲波殺菌技術以期達到預期效果。超聲波是頻率超過20000 Hz的聲波，不能被人耳所感知[12]。人們對超聲波在生物方面的作用研究不斷深入，超聲殺菌技術也不斷發展，首先在發達國家字被普遍使用，逐漸傳入中國，成為一種適用于食品殺菌且效果良好的技術并逐漸獲得人們的青睞。采用超聲波殺菌主要是應用其空化作用在細胞壁與細胞質間的局部部位形成很高的溫度和壓力[13]，使泡菜中的有害微生物的細胞壁被破壞，失去保護屏障，不能存活[14]。將超聲殺菌技術應用于泡菜發酵的優點有滅菌效率高，未損害白菜本身，也不會在泡菜中加入其他風味，較好地將泡菜本身的營養留存，保持了泡菜的健康性和營養性。

當今泡菜發酵趨向多樣化、療效化、營養化、綠色化發展。為了使泡菜更加綠色健康，已有前輩在泡菜中加入維生素C、大蒜、白醋、白酒、葡萄糖、綿白糖、甚至中草藥等改善泡菜品質[15-21]，減少其中亞硝酸鹽含量，并都取得了一定的成果，但效果沒有十分完善，在降低亞硝酸鹽含量的同時，也不可避免地加入了泡菜本身沒有的味道。超聲殺菌技術既能殺滅有害菌，又不傷害泡菜本身，有利于保持白菜的風味，所以本實驗期望利用該技術在減少發酵白菜中亞硝酸鹽含量的同時，保留白菜本身的味道和營養，改善泡菜的品質。用不同時間超聲波處理發酵白菜，探索適合發酵的最適時間，對泡菜食品工業未來的發展具有重要的建設意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

白菜：選取顏色較淺的。NaNO2；無碘食鹽；氨水；顯色劑(對氨基苯磺酸與N-1-萘基乙二胺)；孟加拉紅培養基；NA培養基；MRS固體培養基：購于Sigma-Aldrich化學試劑公司。

BILON92-ILDL超聲波信號發生器 上海比朗儀器有限公司；UV-5100紫外-可見分光光度計 上海元析儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 發酵蔬菜的制備

發酵容器使用250 mL的錐形瓶16個，棉塞用紗布包裹制成瓶蓋，將三角瓶和棉塞一起在立式滅菌器中121 ℃滅菌20 min，冷卻后，無菌條件下在每個錐形瓶中加入60 g用無菌水清洗的白菜和200 mL 4%煮沸后冷卻的NaCl溶液，其中一組不用超聲波處理，其余組用超聲波信號發生器分別對泡菜進行5,15,30 min超聲波處理，之后塞上棉塞，室溫發酵。

1.2.2 取樣

每5 d用不同時間超聲波處理(5,15,30 min)的發酵白菜各2瓶測定指標，在超凈工作臺上用滅過菌的鑷子夾出約2.5 g白菜作為樣品，測定亞硝酸鹽含量。用移液槍吸取1 mL發酵液，稀釋合適倍數進行涂布。另外吸取5 mL發酵液用pH計測定pH。

1.2.3 亞硝酸鹽的測定

亞硝酸鹽含量根據梁文君等的方法進行測定。

1.2.4 pH的測定

從每個錐形瓶中取適量發酵液，用pH計測pH，重復3次，分析及處理數據即可。

1.2.5 亞硝酸鹽生成細菌的分離和計數

使用SAN(sulfanilamide nitrate)瓊脂重層法。(SAN瓊脂：葡萄糖0.5 g，硝酸鈉1.0 g，對氨基苯磺酸0.2 g，瓊脂2.0 g，蒸餾水100 mL)。

將吸取的1 mL發酵液稀釋108后在細菌培養基上涂布，培養1 d后，在形成細菌菌落的培養基上蓋上約15 mL的SAN瓊脂培養基，凝固后于30 ℃培養箱靜置15 min，在培養基表面注入約1 mL 0.1% NEDA(N-1-萘二胺二氫氯化物/2N鹽酸溶液)，亞硝酸鹽生成菌的菌落及菌落周邊會變紅，平板計數法計數即為亞硝酸鹽生成菌數量。

1.2.6 發酵白菜中微生物乳酸菌的計數

在超凈臺中，將制備好的MRS培養基上涂布0.1 mL稀釋的泡菜液(108)，30 ℃倒置培養2 d，用分區的方式記錄數據。

1.2.7 發酵白菜中細菌的計數

在超凈臺中，將制備好的牛肉膏蛋白胨培養基上涂布0.1 mL稀釋的泡菜液(108)，37 ℃倒置培養1 d，用分區的方式記錄數據。

1.2.8 發酵白菜中酵母菌的計數

在超凈臺中，將制備好的虎紅培養基上涂布0.1 mL稀釋的泡菜液(102)，28 ℃倒置培養4 d，用分區的方式記錄數據。

1.2.9 感官指標的測定

按表1的評分標準評分，請10人評分，記錄數據。

表1 泡菜發酵產品的感官指標評分標準

1.3 統計分析試驗結果

試驗結果為3組重復試驗數據的平均值，用統計分析軟件SPSS 22進行Duncan法單因素方差分析。

2 結果分析

2.1 不同時間超聲波處理對發酵白菜亞硝酸鹽含量的影響

表2 發酵白菜中亞硝酸鹽含量

續 表

注：表中數據為平均值±標準誤差，不同字母代表不同處理間顯著性差異(P<0.05),下同。

由表2可知，從泡菜發酵的時間來看，第5,10,15,20天泡菜體系中的亞硝酸鹽含量均為超聲波處理實驗組顯著低于對照組。不同時間超聲波處理對亞硝酸鹽含量的影響不同，15 min超聲波處理的泡菜亞硝酸鹽含量最低，與對照組的差異極顯著(P<0.01)，5，30 min處理組的亞硝酸鹽含量低于對照組，與對照組相比差異顯著(P<0.05)，效果次于15 min。

2.2 不同時間超聲波處理對發酵白菜pH的影響

表3 發酵白菜的pH

由表3可知，發酵白菜的pH隨著時間的延長逐漸下降，達到一定酸度便會保持平衡。發酵5 d， pH下降，到15 d， pH趨于穩定。在不同時間超聲波處理的泡菜中，15 min超聲波處理的pH下降程度最高也最快，經過統計分析證明15 min處理的pH顯著低于其他組(P<0.05)。

2.3 不同時間超聲波處理對發酵白菜中亞硝酸鹽生成菌數量的影響

表4 發酵白菜中亞硝酸鹽生成菌數量

由表4可知，從泡菜發酵的時間來看，第5，10，15，20天泡菜體系中的亞硝酸鹽生成菌的數量均為超聲波處理實驗組顯著低于對照組。不同時間超聲波處理對亞硝酸鹽生成菌數量的影響不同，15 min超聲波處理的發酵白菜亞硝酸生成菌數目最低，與對照組差異極顯著(P<0.01)，降低程度也較5，30 min明顯，可見這組處理對亞硝酸鹽生成菌的抑制作用最好。

2.4 不同時間超聲波處理對發酵泡菜乳酸菌數量的影響

從泡菜發酵的時間來看，第5，10，15天泡菜乳酸菌數量顯著升高，到第20天顯著性又降低，而且第15天乳酸菌數量顯著高于其他時間，15 min的乳酸菌數量最高，即超聲波處理15 min的泡菜最好，見表5。

表5 泡菜發酵液中乳酸菌數量的變化

從超聲波處理時間可以看出，超聲波處理15，5 min的泡菜乳酸菌數量極顯著高于對照組(P<0.01)，而30 min極顯著低于對照組(P<0.01)，第15天乳酸菌數量最高，說明第15天的泡菜比較適合食用。

2.5 不同時間超聲波處理對發酵泡菜細菌數量的影響

從泡菜發酵的時間來看，第5，10，15天泡菜細菌數量顯著降低，到第20 d顯著性又增加，而且第15天細菌數量顯著低于其他發酵時間，說明超聲波處理15 min的泡菜最好，見表6。

表6 泡菜發酵液中細菌數量

從超聲波處理時間可以看出，超聲波處理時間為15，5，30 min的泡菜發酵產品的細菌數量顯著低于對照組，并且15 min的處理組最顯著，說明泡菜在第15天比較適合食用。

2.6 不同時間超聲波處理對發酵泡菜酵母菌數量的影響

從泡菜發酵的時間來看，第5，10，15天泡菜酵母菌數量顯著升高，到第20天顯著性又降低，而且第15天酵母菌數量顯著性高于其他發酵時間，說明超聲波處理15 min的泡菜最好，見表7。

表7 泡菜發酵液中酵母菌數量的變化

從超聲波處理時間可以看出，超聲波處理15 min的泡菜酵母菌數量極顯著高于對照組，而5，30 min極顯著低于對照組。酵母菌數量是評價泡菜風味的重要指標之一，第15天酵母菌數量最高，說明第15天的泡菜比較適合食用。

2.7 不同時間超聲波處理對發酵泡菜感官品質的影響

從泡菜發酵的時間來看，第5，10，15天泡菜感官評分顯著增加，到第20天顯著性降低。第15天評分顯著性高于其他時間，說明第15天的泡菜比較適合食用，而且第15天的泡菜香氣正、口感、咀嚼感與其他時間相比最好，適合食用，見表8。

表8 泡菜發酵產品的感官指標評分

從超聲波處理時間可以看出，超聲波處理5，15 min的泡菜感官品質評分極顯著高于對照組，而30 min則低于對照組。15 min的分數最高說明超聲波處理15 min的泡菜是最好的，而且其泡菜顏色均勻、菜湯清亮、香氣比較正、酸甜，口感、咀嚼感都比較好，很適合食用。

3 討論

由于制備泡菜時蔬菜未經過滅菌，蔬菜中的多種微生物共同生存，在泡菜發酵初期，蔬菜表面所帶微生物在發酵體系處于優勢，不含硝酸鹽還原酶的乳酸菌生長代謝不旺盛，此階段產生亞硝酸鹽的主要菌落是蔬菜中攜帶的雜菌如大腸桿菌、假單胞子菌等硝酸還原菌[22]。本研究利用超聲波的殺菌功能旨在抑制泡菜發酵初期的雜菌，尤其是抑制亞硝酸鹽生成菌。由實驗結果可知，超聲波處理后，泡菜體系細菌和亞硝酸鹽生成菌數量較對照顯著減少。

朱紹華[23]利用超聲波對醬油進行滅菌實驗，處理10 min后,滅菌率為75%。梁蕊芳等[24]通過研究超聲波對食品污染性菌種的破碎效果發現細菌對超聲波處理敏感，破碎率達96%，而真菌對其不敏感，破碎率較低。由實驗結果可知，超聲波處理后，泡菜體系細菌數量顯著減少，而酵母菌數量先增加之后降低。

就超聲波處理時間而言，從本實驗數據可以看出，在一定范圍內，超聲波殺菌效果與超聲波處理時間成正比，即殺菌率隨超聲波處理時間的增長而提升，但處理時間過長，殺菌率將下降。張弛等人的研究表明[25]，超聲波頻率一定時，聲波膨脹時間縮短，并且微小氣泡沒有足夠的時間生長到可以產生空化效應的程度，或者氣泡大小適宜但是未到破裂的時間，無法破裂。超聲波作用時會產生空化效應和熱效應，使得小氣泡在坍塌時會產生高溫、高壓，使得細菌等微生物的細胞壁或細胞核被破壞。本實驗中當超聲波處理時間為10 min時，由于超聲波處理時間太短，雖然氣泡生長到足夠的大小，但處于壓縮相的時間不足，氣泡來不及破裂，所以無法產生高熱高壓來破壞細胞，而且對植物細胞壁以及細菌細胞壁破壞很小，因此此時的泡菜質感比較脆，而且口感也比較好，菌的相對含量較高，這也與張弛等人的研究結果一致；進一步研究證明，一定的超聲波處理時間使得細菌細胞壁通透性增大恰到好處，使其能夠很好地生長，但時間太長會破壞細胞的細胞壁，使得細胞無法完成自我修復。所以，本實驗中隨著超聲波處理時間的延長至15 min時，空化效應所形成的小氣泡有足夠的時間形成并破裂，從而使得微生物細胞膜局部變薄，通透性也增大恰到好處，使得細胞膜兩側的物質交換率增加，有利于菌體的大量繁殖，特別是乳酸菌、酵母菌，乳酸菌大量繁殖使得泡菜的品質、風味變得更好，所以此時的泡菜口感等是最好的。當處理時間延長至30 min時，由于處理時間過長，細菌的細胞壁被破壞，細胞無法完成自我修復，細胞死亡，所以相應的菌數量有所下降，再者超聲波處理時間太長，破壞細胞壁組分，所以30 min泡菜細胞壁變軟，口感、彈性也有所下降。

食品經過非熱殺菌技術處理后，主要結構物質仍保持其正常的三維結構，執行正常的生理功能，所以能較好地保存其營養性[26]，超聲處理過程并未伴隨溫度的升高，屬于冷殺菌技術，因此不會使蔬菜中的營養物質結構改變，能較好地保留泡菜的營養，維持發酵白菜的品質和風味，是一種適用于食品殺菌且效果優良的殺菌技術。

4 結論

本實驗旨在研究能降低發酵白菜亞硝酸鹽含量的最適宜的超聲波處理時間，并對不同發酵時間、超聲波處理時間的亞硝酸鹽含量、亞硝酸鹽生成菌落數、pH進行數據分析，15 d后，15 min超聲波處理條件下，亞硝酸鹽生成菌為9.12 log CFU/mL，亞硝酸鹽含量為3.10 mg/kg，pH低至4.28，對亞硝酸鹽的抑制效果最好，最適合發酵。

超聲波處理15，5 min的泡菜在第15天感官品質評分分別為96，86分，均顯著高于對照組(83分)，而30 min(78分)則低于對照組；超聲波處理15，5 min的泡菜在第15天乳酸菌數量分別為10.54，10.39 log CFU/mL，均顯著高于對照組的10.37 log CFU/mL，而30 min(10.11 log CFU/mL)顯著低于對照組。