正交試驗優化苦蕎黃酮提取工藝

米智，劉荔貞，武曉紅，梁艷茹

(1.山西大同大學 生命科學學院，山西 大同 037009；2.山西大同大學 化學與環境工程學院，山西 大同 037009)

蕎麥屬于雙子葉蓼科類植物[1]，分為普通蕎麥和苦蕎麥兩種。苦蕎即苦蕎麥，學名韃靼蕎麥，別名蕎葉七、野蘭蕎、萬年蕎、菠麥、烏麥、花蕎等，起源于我國西南部，栽培于我國東北、內蒙古、河北、山西、陜西、甘肅、青海、四川、云南等地。亞洲、歐洲和北美也有栽培[2,3]。苦蕎中含有大量的營養物質，包括碳水化合物、葡萄糖、蛋白質、多酚類、植物固醇、維生素、油酸、亞油酸、類胡蘿卜素、微量元素和礦物質等。苦蕎麥中富含人體必需的8種氨基酸，是糧食中氨基酸含量之首。此外，苦蕎中的維生素、礦物質和黃酮類物質也遠高于其他作物，由于其富含黃酮類化合物，具有多種生理功能，被譽為“藥食同源作物”[4]，也有“五谷之王”的美稱[5]。《本草綱目》記載：“苦蕎味苦，性平寒，能實腸胃，益氣力，續精神，利耳目，煉五臟渣穢”[6]。

與普通蕎麥相比，苦蕎含有更多的蘆丁、槲皮素、山奈酸、蕓香糖苷等黃酮類物質[7]，這些具有生物活性成分的苦蕎黃酮對人體有抗氧化、清除氧自由基、降血糖、降血脂、改善認知功能、抗高血壓和抗動脈粥樣硬化等作用，被譽為“三降食品”(降血糖、降血脂和降血壓)[8]。同時還具有抑菌、抗病毒、防癌、預防多種慢性疾病等功效，在食品加工中廣泛用于各種糕點、調味食品、保健食品等的生產，深受人們的喜愛[9-11]。產于山西的苦蕎麥中總黃酮含量顯著高于湖南、寧夏、貴州、云南等地的苦蕎麥[12]。

目前，關于苦蕎黃酮不同部位化合物分離、提純的研究較多，主要有對苦蕎麩皮黃酮的乙醇浸提法和微波提取法[13，14]；也有大孔樹脂分離法和酶提取法[15，16]；但對苦蕎食用部位麥粒黃酮的提取方法主要有傳統的水煎煮法和超臨界流體萃取法[17]。本文采取的索氏提取法具有選擇性好、能耗低、設備操作簡便等優點，適于實驗室應用；黃酮易溶于甲醇、乙醇、丙酮等有機溶劑，但甲醇和丙酮均具有一定的毒性，乙醇無毒且沸點低，適于索氏提取法進行苦蕎麥粒中黃酮的提取，且使用乙醇為提取劑時回收利用方便，乙醇回流法提取的黃酮要比水煎煮高得多，有利于降低生產成本[18]。以苦蕎麥粒為研究對象，利用正交試驗探究索氏提取法提取苦蕎麥粒中黃酮的最佳工藝條件，為苦蕎麥粒中黃酮的開發利用提供了參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

山西廣靈苦蕎：山西省農業科學院高寒作物研究所提供；蘆丁標準品：南京奧多福尼生物科技有限公司；無水乙醇、硝酸鋁、亞硝酸鈉、氫氧化鈉等。

1.2 儀器與設備

恒溫水浴鍋、酸度計、精密電子天平、真空抽濾裝置、數顯恒溫水浴鍋、紫外/可見分光光度計、高速中藥粉粹機、索氏提取器等。

1.3 方法

1.3.1 蘆丁標準曲線的建立

準確稱取蘆丁標準品10 mg，加少量乙醇，在超聲波輔助下，搖勻使之充分溶解并定容至50 mL，得0.2 mg/mL蘆丁標準液[19]。

取6個干燥潔凈的25 mL容量瓶，按表1的順序加入試劑。

表1 蘆丁標準曲線的制作

以0號容量瓶為空白對照，在510 nm處用紫外/可見分光光度計測定吸光值，測定3次求平均值，做回歸處理。

1.3.2 苦蕎處理及黃酮提取工藝流程

選擇無發霉、無機械傷、無病蟲害、顆粒飽滿的苦蕎種子，放入電熱恒溫鼓風干燥箱中，在50 ℃下干燥2 h后，用萬能粉碎機粉碎成苦蕎粉末，并使苦蕎粉通過60目篩，收集苦蕎粉末于干燥的容器中待用。

黃酮提取工藝流程：苦蕎→清選→烘干→粉碎→過篩→稱重→分裝小包→乙醇回流浸提→提取液定容→測定吸光值→計算提取率。

1.3.3 苦蕎總黃酮的測定方法

精確量取1 mL提取液作為待測液，方法同1.3.1，在510 nm處測吸光值，做3組平行試驗求平均值，代入線性回歸方程，得到苦蕎總黃酮的含量。

式中：C為苦蕎總黃酮濃度，mg/mL；N為稀釋的倍數；V為提取液總體積，mL；W為樣品的質量，g；1000為mg和g之間的轉化率。

1.3.4 苦蕎總黃酮提取工藝的單因素試驗[20]

1.3.4.1 乙醇濃度

準確稱取苦蕎粉末2 g，在加醇量為苦蕎質量的7倍、回流時間為2 h、提取次數為2次的前提下，設置乙醇濃度為50%、60%、70%、80%、90%提取苦蕎中的總黃酮，并在510 nm處測定提取液的吸光值，計算黃酮提取率。

1.3.4.2 乙醇添加倍數

準確稱取苦蕎粉末2 g，在乙醇濃度為70%、回流時間為2 h、提取次數為2次的前提下，設置乙醇添加量為苦蕎質量的6，7，8，9，10倍提取苦蕎中的總黃酮，并在510 nm處測定提取液的吸光值，計算黃酮提取率。

1.3.4.3 提取次數

準確稱取苦蕎粉末2 g，在乙醇濃度為70%、回流時間為2 h、加醇量為苦蕎質量7倍的前提下，設置提取次數為1，2，3，4，5次提取苦蕎中的總黃酮，并在510 nm處測定提取液的吸光值，計算黃酮提取率。

1.3.4.4 回流時間

準確稱取苦蕎粉末2 g，在乙醇濃度為70%、加醇量為苦蕎質量的7倍、提取次數為2次的前提下，設置回流時間為1，1.5，2，2.5，3 h提取苦蕎中的總黃酮，并在510 nm處測定提取液的吸光值，計算黃酮提取率。

1.3.5 苦蕎總黃酮提取工藝的正交試驗

準確稱取苦蕎粉末2 g，參考1.3.4單因素試驗結果，在乙醇濃度、加醇量、提取次數和回流時間4個單因素中，分別選出3個對苦蕎總黃酮提取率影響最大的水平，做L9(34)正交試驗。

1.3.6 苦蕎總黃酮提取工藝的驗證性試驗

為了更好地證實乙醇回流法提取苦蕎總黃酮的可靠性和合理性，在正交試驗的基礎上，進行了3次平行試驗，分別計算出該條件下的最佳提取率。

2 結果與分析

2.1 標準曲線的繪制

以蘆丁濃度(C，m/V)為橫坐標，吸光值OD510為縱坐標，制作標準曲線，得出線性回歸方程：y=9.167x+0.171，R2=0.991。

2.2 苦蕎總黃酮提取工藝的單因素試驗結果

2.2.1 乙醇濃度對苦蕎黃酮提取率的影響

圖1 不同乙醇濃度對苦蕎黃酮提取率的影響

由圖1可知，當乙醇濃度低于70%時，苦蕎黃酮提取率隨乙醇濃度增大而提高，在乙醇濃度為70%時黃酮提取率達到最大，約為2.84%；當乙醇濃度超過70%后，隨著乙醇濃度的提高，黃酮提取率反而降低。因此在做正交試驗時，選取乙醇濃度分別為60%、70%、80%作為3個水平。

2.2.2 乙醇添加倍數對苦蕎黃酮提取率的影響

圖2 乙醇添加倍數對苦蕎黃酮提取率的影響

由圖2可知，苦蕎黃酮提取率隨著乙醇添加量的增大而提高，當乙醇添加量是苦蕎質量的7倍時，苦蕎黃酮提取率達到最大值，約為2.86%；當乙醇添加量超過苦蕎質量的7倍時，隨著乙醇添加量的增加，黃酮提取率反而降低。因此在做正交試驗時，選取乙醇添加量分別為苦蕎質量的6，7，8倍作為3個水平。

2.2.3 提取次數對苦蕎黃酮提取率的影響

由圖3可知，苦蕎黃酮提取率隨著提取次數的增加而提高，當提取3次時，黃酮提取率達到最高值，約為3.17%，隨著抽提次數的增加，苦蕎黃酮的提取率反而降低。因此在做正交試驗時，選取抽提次數分別為2，3，4次作為3個水平。

圖3 提取次數對苦蕎黃酮提取率的影響

2.2.4 回流時間對苦蕎黃酮提取率的影響

圖4 回流時間對苦蕎黃酮提取率的影響

由圖4可知，當回流時間不足2 h時，苦蕎黃酮提取率隨著回流時間的延長而提高，且回流2 h時黃酮提取率達到最大值，約為2.95%，隨著回流時間的延長，苦蕎黃酮提取率反而有所降低。因此在做正交試驗時，選取回流時間分別為1.5，2，2.5 h作為3個水平。

2.3 苦蕎總黃酮提取工藝的正交試驗結果

正交試驗設計見表2。

表2 L9(34)正交試驗因素水平表

表3 苦蕎黃酮提取正交試驗結果與分析

續 表

由表3可知，最佳的提取工藝條件為A2B2C3D1，由極差值R的大小可知各因素對本試驗方法的影響次序為：C(乙醇濃度)>B(提取次數)>D(回流時間)>A(加醇量)。

由表4可知，在索氏提取法提取苦蕎黃酮工藝中，選取的4個因素乙醇濃度、加醇量、回流時間和提取次數對苦蕎黃酮提取率的影響均不顯著。

2.4 優化條件的驗證性試驗

根據正交試驗結果分析，篩選出苦蕎總黃酮提取的最佳工藝，然后進行3組重復試驗，對正交試驗結果的可靠性和準確性進行驗證。測得苦蕎黃酮得率，見表5。

由表5可知，3組平行樣數據的RSD為0.28%，滿足要求，得出該提取工藝條件下苦蕎黃酮提取率較為穩定。

3 結論

由正交試驗結果及方差分析可知，索氏提取法提取苦蕎黃酮的最佳工藝為：乙醇添加量為苦蕎質量的7倍，提取3次，乙醇濃度為80%和回流時間為1.5 h。影響程度為：乙醇濃度>提取次數>回流時間>加醇量，4個因素對苦蕎黃酮提取率的影響均不顯著。由驗證性試驗可知，該工藝黃酮提取率最高，相對標準偏差(0.28%)較小，試驗穩定可靠。為今后研究苦蕎中黃酮等成分的提取提供了試驗依據。