ARTP誘變技術選育高產谷氨酰胺酶的曲霉菌種

周其洋，張書泰

(佛山市海天(高明)調味食品股份有限公司，廣東 佛山 528500)

谷氨酸是醬油等調味食品中最關鍵的呈味物質之一，是衡量醬油質量的重要指標之一[1,2]。醬油釀造原料中含有40%～50%的谷氨酰胺，如果能夠將其轉化為谷氨酸，不僅能提升原料的利用率，而且是釀造天然高品質原油的技術支撐[3]。在醬油釀造過程中，米曲霉所產的谷氨酰胺酶是將谷氨酰胺水解為谷氨酸最重要的關鍵酶[4,5]。

與添加外源谷氨酰胺酶產品相比，通過菌種誘變選育高產谷氨酰胺酶的米曲霉，既提高了醬油的谷氨酸含量，降低了生產成本，又保證了釀造醬油的色、香、味[6-9]。傳統的菌種誘變方法包括物理誘變(如紫外、60Co、N+離子注入等)和化學誘變(如EMS、亞硝基胍等)。其中物理誘變回復突變嚴重，且多年的誘變容易形成誘變疲勞，而化學誘變的誘變劑多具有強致癌性[10-12]。常壓室溫等離子體(atmospheric and room temperature plasma，ARTP)生物誘變育種技術是一種新型的誘變手段，具有射流溫度低，產生的等離子體均勻，無需真空裝置，操作簡便，成本低，與生物大分子和細胞作用明顯等優點[13-17]。目前已經在提升米曲霉產曲酸和蛋白酶活力方面取得了良好效果，但尚未有利用ARTP誘變選育谷氨酰胺酶高產菌株的報道。

本研究利用剛萌發的孢子這一敏感受體，采用ARTP誘變技術進行誘變，結合平板快速篩選和96孔板高通量檢測，建立了一套針對谷氨酰胺酶的米曲霉菌種高通量誘變選育方法，并通過醬油發酵驗證了目標菌株在高產谷氨酸方面的突出效果。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 出發菌株

滬釀3.042：購自廣東省微生物研究所；菌株3.811、336-2、A98和A1428：由本公司菌種保藏中心提供。

1.1.2 培養基

斜面培養基：KH2PO41 g，MgSO40.5 g，(NH4)2SO40.5 g，可溶性淀粉20 g，豆汁1000 mL，于115 ℃滅菌15 min。

平板初篩培養基：L-谷氨酰胺10 g，酵母浸膏5 g，K2HPO41 g，KH2PO40.1 g，MgSO40.5 g，酚紅0.015 g，于121 ℃滅菌15 min。

復篩培養基(種曲培養基)：麩皮12 g，豆粕3 g，水8 mL于250 mL容量瓶中，攪拌均勻后于121 ℃滅菌15 min。

制曲培養基：豆粕∶麩皮∶水為80∶20∶60，攪拌均勻后于121 ℃滅菌15 min。

1.1.3 試劑

L-谷氨酰胺：純度>99%，美國西格瑪奧德里奇公司(Sigma-Aldrich)生產；谷氨酸檢測試劑盒：德國拜發公司(R-Biopharm)生產；其他試劑：均為分析純，采用雙蒸水配制。

1.1.4 主要儀器

SKY-2102C恒溫振蕩搖床 上海蘇坤實業有限公司；恒溫培養箱(HPS-200生化培養箱) 北京東聯哈爾儀器制造有限公司；LB941多功能酶標儀 德國Berthold公司；ARTP-Ⅲ誘變育種儀 思清源生物科技有限公司；臺式離心機 上海盧湘儀離心機儀器有限公司；TD5M-WS多管架自動平衡離心機；Thermo Shaker微孔板恒溫振蕩器。

1.2 實驗方法

1.2.1 出發菌株的選擇

對菌株滬釀3.042、3.811、336-2、A98和A1428進行酶系及發酵性能測定，選擇綜合性能較好的菌株作為出發菌株。

1.2.2 孢子萌發敏感體的培育

孢子懸浮液的制備：選擇成熟的斜面菌種，用孢子鏟鏟取一平鏟孢子于裝有50 mL生理鹽水(另外添加了0.1%吐溫80)的150 mL三角瓶中，三角瓶中裝有玻璃珠，于恒溫振蕩搖床200 r/min振蕩10 min，過G2砂芯漏斗，得孢子懸浮液，用血球計數板計數后，調整濃度為108個/mL。

萌發敏感體的培育：吸取孢子懸浮液，按10%(V/V)接種量接種到YPD培養基中，于恒溫震蕩搖床中160 r/min，30 ℃培養4 h，使得孢子剛剛萌發，用G3砂芯漏斗過濾去除未萌發的孢子，截留萌發的孢子，用生理鹽水洗下，重懸，用血球計數板計數后，調整濃度為107個/mL，獲得萌發敏感體菌懸液，備用。

1.2.3 ARTP誘變時間的確定

選擇不同的誘變處理時間(20，40，60，80，100，110，120，140，160 s)，在功率120 W、氣流量10 L/min的條件下，對萌發敏感體進行ARTP誘變，以未經誘變的菌懸液為對照，涂布平板，計算致死率。

1.2.4 誘變菌株平板初篩

孢子萌發敏感體經ARTP誘變后，將孢子液進行適當稀釋，進行涂布，于30 ℃培養。在平板培養基上，挑選生長速度快、紅色變色圈大的菌落，接種試管斜面，確定為初篩菌株。

1.2.5 誘變菌株制曲復篩

將初篩菌株進行小規模制曲發酵，檢測成曲的孢子數、中性蛋白酶、纖維素酶、果膠酶、糖化酶、淀粉酶、谷氨酰胺酶活力。其中，孢子數的檢測方法參照文志州的方法；中性蛋白酶、淀粉酶、谷氨酰胺酶活力的檢測方法參照李荔等的方法；纖維素酶、果膠酶、糖化酶的檢測方法參照譚永水等的方法[18-20]。

1.2.6 誘變菌株快速發酵

采用高鹽稀態發酵法，于30 ℃發酵20 d。發酵醪汁過濾，取濾液檢測發酵原油的總酸、氨基氮、谷氨酸指標。篩選綜合性能優異的菌株，確定為復篩菌株。

1.2.6.1 總酸、氨基氮的測定

總酸和氨基氮的檢測參照李荔等的方法。

1.2.6.2 L-谷氨酸的測定

L-谷氨酸采用德國拜發公司(R-Biopharm)的谷氨酸檢測試劑盒進行檢測。

1.2.7 原油氨基酸分析

過濾醬渣，取過濾的醬油測得游離氨基酸。測定過程委托中廣測進行測定。

2 結果與分析

2.1 出發菌株的選擇

通過制曲測定菌株滬釀3.042、3.811、336-2、A98和A1428的孢子數、中性蛋白酶、纖維素酶、果膠酶、糖化酶、淀粉酶、谷氨酰胺酶的活力；通過快速醬油發酵測定其總酸、氨基氮、谷氨酸等指標，結果見表1。

表1 出發菌株主要指標檢測結果

由表1可知，菌株A1428綜合酶活力和醬油發酵后L-谷氨酸含量相對較高。因此，以菌株A1428為出發菌株進行ARTP誘變，選育高產谷氨酰胺酶活力的菌株。

2.2 ARTP誘變時間的確定

將菌株A1428孢子懸浮液適當稀釋后，取10 μL在誘變育種儀上進行誘變，設定功率為120 W，氣流量為10 L/min。誘變時間為20，40，60，80，100，110，120，140，160 s，以0 s作為對照，誘變結束后用生理鹽水洗滌墊片，適當稀釋后取100 μL涂布，于30 ℃培養72 h，計算誘變致死率，見圖1。

圖1 ARTP致死率曲線圖

由圖1可知，隨著誘變處理時間的延長，曲霉致死率逐漸上升。當誘變處理時間為40～100 s時，曲霉致死率變化較小，均在80%左右。誘變時間增加至120～140 s時，致死率達到90%～95%；當處理時間達到160 s時，曲霉致死率達到100%。為了獲得較高正突變率和較高高產谷氨酰胺酶活力的菌株，本試驗將致死率設定在90%以上。因此，選擇120 s作為ARTP的誘變處理時間。

2.3 誘變菌株初篩平板

菌株A1428孢子萌發敏感體經ARTP誘變后，在平板培養基上篩選得到5株生長快、顏色變化快、色澤深的菌落作為初篩菌株，見圖2。

圖2 誘變菌株平板初篩

2.4 誘變菌株小試復篩分析

將初篩得到的誘變菌株酶活力和發酵進行小試復篩。選擇醬油制曲中菌株孢子數、中性蛋白酶活力、淀粉酶活力和谷氨酰胺酶活力評價初篩菌株酶活力。以發酵后原油總酸、氨基氮和L-谷氨酸含量評價菌株發酵性能，結果見表2。

表2 誘變菌株制曲指標測定結果

由表2可知，制曲階段誘變菌株A17的孢子數僅為59億個/g，不適于工業生產應用。誘變菌株A235的中性蛋白酶活力太低，不利于曲料中蛋白質水解和原料利用。誘變菌株A103、A380和A457中，菌株A380的綜合酶活力較高，孢子數適宜。其中，誘變菌株A380制曲階段谷氨酰胺酶活力最高，發酵階段氨基氮含量和L-谷氨酸含量較高。

2.5 菌株發酵原油氨基酸比較

發酵結束后，過濾醬渣，取過濾的醬油測得游離氨基酸，比較菌株A1428及誘變菌株A380發酵原油中16種氨基酸分布，結果見表3。

表3 原油游離氨基酸含量比較

續 表

由表3可知，2株菌株發酵原油16種氨基酸中谷氨酸含量占比最高，菌株A380的游離氨基酸總量高于A1428。其中，菌株A380原油鮮味氨基酸Glu和Asp較菌株A1428高，這可能與菌株谷氨酰胺酶活力存在差異有關；菌株A380和A1428原油甜味氨基酸(Thr、Ser、Pro、Gly、Ala)所占比例分別為32%和37%；菌株A380和A1428原油苦味氨基酸(Met、Ile、Leu、Phe、His、Lys、Arg)所占比例分別為35%和26%[21,22]。氨基酸含量是醬油風味的一個重要指標，菌株A380原油中鮮味氨基酸、甜味氨基酸較出發菌株A1428都有一定的提升，苦味氨基酸相對較低，具有一定的應用價值。

3 結論

本文以綜合性能優良的醬油生產曲霉菌株A1428為出發菌株，利用ARTP作為誘變方法，最佳誘變條件為：功率120 W，氣流量10 L/min，誘變時間120 s。經平板初篩和醬油制曲、發酵復篩，結合96孔板法建立高通量篩選誘變菌株的方法，得到一株高產谷氨酰胺酶菌株A380。該菌株谷氨酰胺酶活力較出發菌株高25%，發酵原油谷氨酸含量提高了20%。比較出發菌株和誘變菌株A380發酵原油氨基酸分布，發現菌株A380原油中鮮味氨基酸、甜味氨基酸較出發菌株A1428都有一定的提升，苦味氨基酸相對較低。

誘變菌株A380的中性蛋白酶和淀粉酶相比出發菌株都有一定的提升，對原料中蛋白質等大分子的分解、轉化都有重要的作用。下一步可擴大試驗規模，繼續研究誘變菌株A380的穩定性、抗雜菌能力，以及氨基氮生產率、谷氨酸生成率、全氮水解率和原料利用率等經濟指標，為工業化生產奠定基礎。