豌豆蛋白和多糖同步提取工藝優化及其抗氧化活性研究

秦高一鑫 裴 斐 袁 彪 趙立艷 胡秋輝, 陳貴堂

(中國藥科大學工學院1，南京 211198) (南京財經大學食品科學與工程學院;江蘇省糧油品質控制及深加工技術重點實驗室2，南京 210023) (南京農業大學食品科技學院3，南京 210095)

豌豆，又名麥豌豆、寒豆、麥豆、荷蘭豆(軟莢豌豆)。原產地位于歐洲南部及沿岸，豌豆是一種適應性很強的作物，地理分布很廣，全世界約有93個國家生產干豌豆，我國是世界第二大豌豆生產國，產量占全世界的三分之一[1,2]。豌豆的營養全面而均衡，富含蛋白質、碳水化合物和膳食纖維，同時脂肪含量很低，是B族維生素、葉酸和鈣、鐵、鉀等礦物質的一個極好來源[3]。現代藥理表明豌豆有增強機體免疫、防癌治癌等功效，藥用價值十分明顯。高豌豆的飲食可以有效降低結腸癌、Ⅱ型糖尿病、低密度脂蛋白膽固醇和心臟病的發病率[4]。

豌豆蛋白是一種優質的植物蛋白，占豌豆干質量的22%～25%，富含必需氨基酸異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、色氨酸和賴氨酸[5-7]。研究表明，豌豆蛋白在運動營養補充效果上媲美乳清蛋白，也有助于改善血壓及腎病[8]。多糖是由多種單糖通過糖苷鍵連接組成的高分子化合物，具有多種生物活性。豌豆多糖是豌豆中的主要營養成分之一，水溶性好，黏度低，溶解后穩定性好且不易受溫度、酸度及鹽類的影響，是一種理想的天然食品添加劑[9-11]。糖蛋白由糖和蛋白兩部分通過共價鍵連接組成，是生物體內的一種重要的生物大分子，在生長發育、信息傳遞、免疫系統、神經系統等多種生命活動中起重要作用[12-14]。目前對于豌豆蛋白的深入研究已經有諸多文獻報道，但對于豌豆多糖的提取工藝研究很少，本研究在對豌豆蛋白提取的同時也對其多糖成分進行了提取，工藝步驟簡單便于操作，大大增加了豌豆資源的利用。并對同步提取獲得的2種樣品進行抗氧化活性的測定，為其進一步的開發和利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

過100目篩豌豆粉；牛血清白蛋白；L(+)-抗壞血酸，葡萄糖，1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)，2,2’-連氮基-雙-(3-乙基苯并二氫噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)。

1.2 主要儀器

HH-8數顯恒溫攪拌循環水箱；WFJ-15型超微粉碎機；RE-5205旋轉蒸發儀；TU-1901雙光束紫外可見分光光度計；LXJ-ⅡB型低速大容量多管離心機；FD-1C-50冷凍干燥機。

1.3 實驗方法

1.3.1 原料預處理

干豌豆用粉碎機粉碎，過100目篩，石油醚脫脂，50 ℃減壓干燥后密封保存在低溫干燥避光的環境中備用。

1.3.2 豌豆蛋白、多糖同步提取工藝

精確稱取一定量豌豆粉，按照料液比加入一定量的蒸餾水，用1 mol/L的氫氧化鈉調節提取溶液的pH，在設定溫度條件下水浴攪拌提取一定時間，期間每隔30 min調節一次pH以維持提取液pH穩定。待提取液冷卻至室溫后4 000 r/min離心10 min，收集離心上清液，用1 mol/L的鹽酸調節上清液的pH至豌豆蛋白的等電點，待蛋白質產生絮狀沉淀后放入冰箱靜置，使蛋白質進一步沉淀。4 000 r/min離心10 min，收集沉淀用95%乙醇洗滌沉淀，用0.02 mol/L pH為7.4的PBS復溶后透析，冷凍干燥，即得豌豆蛋白成品；上清液用1 mol/L的氫氧化鈉調節pH至中性，旋轉蒸發至適量體積，用Sevage試劑除蛋白3次，4 000 r/min離心10 min，收集上清液，加入3倍體積的95%乙醇，放入冰箱靜置，使沉淀析出。4 000 r/min離心10 min，收集沉淀，分別用無水乙醇和丙酮洗滌3次后用蒸餾水溶解，透析后冷凍干燥，即得豌豆多糖成品。

1.3.3 豌豆蛋白等電點測定

將豌豆提取液離心后取上清液分成若干份，用1 mol/L的鹽酸調pH至3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0，靜置1 h，4 000 r/min離心10 min，將上清液定容至一定體積，通過考馬斯亮藍染液比色法測紫外吸光度，代入標準曲線計算沉淀前后上清液中蛋白質的質量，利用公式計算豌豆蛋白的沉淀率，選取沉淀率較高的pH范圍，再以0.1為梯度調節pH對蛋白進行沉淀，測定沉淀率，沉淀率最大值對應的pH即為豌豆蛋白的等電點。

蛋白沉淀率=(酸沉淀前上清液中蛋白質的質量-酸沉淀后上清液中蛋白質的質量)/酸沉淀前上清液中蛋白質的質量×100%

1.3.4 單因素實驗

分別考察pH 7.0、8.0、9.0、10.0、11.0；提取時間30、60、90、120、150 min；提取溫度20、30、40、50、60 ℃；液料比20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1 mL/g對豌豆蛋白和多糖提取率的影響，每組實驗重復3次，取平均值。

1.3.5 正交實驗設計

根據單因素實驗結果，以蛋白和多糖同步提取率為考察指標，對pH、提取時間、提取溫度、液料比4個影響因素按L9(34)的正交表排列進行實驗，正交因素水平表如表1所示。

表1 正交實驗因素和水平表

1.3.6 豌豆蛋白和多糖提取率、得率及純度的測定

以牛血清白蛋白為標準品，利用考馬斯亮藍染液比色法[15]測定蛋白提取率；以葡萄糖為標準品，利用苯酚-硫酸法[16]測定多糖提取率。得率均采用稱重法計算，蛋白和多糖凍干樣品的純度也采用比色法計算。

蛋白提取率=提取液中蛋白的質量(g)/原料的質量(g)×100%

多糖提取率=提取液中多糖的質量(g)/原料的質量(g)×100%

蛋白得率=蛋白凍干樣品的質量(g)/原料的質量(g) ×100%

多糖得率=多糖凍干樣品的質量(g)/原料的質量(g) ×100%

蛋白純度=蛋白凍干樣品中蛋白的質量(g)/蛋白凍干樣品的質量×100%

多糖純度=多糖凍干樣品中蛋白的質量(g)/多糖凍干樣品的質量×100%

1.3.7 抗氧化活性測定

分別配制不同濃度(0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL)的豌豆蛋白溶液、糖蛋白溶液和抗壞血酸溶液，其中抗壞血酸作為陽性對照。

1.3.7.1 DPPH自由基清除率測定

參考文獻[17]的方法，在2 mL不同濃度的樣品溶液中加入3 mL 0.1 mmol/L用無水乙醇溶解的DPPH溶液，振蕩搖勻，30 ℃水浴中避光反應30 min，于517 nm處測定吸光度值，DPPH自由基清除能力計算公式為：

清除率=[1-(A1-A2)/A0]×100%

式中：A1為樣品或抗壞血酸溶液的測定值；A2為樣品溶液加入3 mL無水乙醇后的測定值；A0為空白對照，即2 mL的樣品溶液換為2 mL的H2O后的測定值。

1.3.7.2 羥自由基清除率測定

參考文獻[18，19]的方法，向2 mL不同濃度的樣品溶液中加入1 mL 6 mmol/L的FeSO4溶液和1 mL 6 mmol/L的H2O2，混合搖勻后靜置10 min，然后加入1 mL 6 mmol/L用無水乙醇溶解的水楊酸，振蕩搖勻后靜置30 min，于510 nm處測定吸光度值，羥自由基清除能力計算公式為：

清除率=[1-(A1-A2)/A0]×100%

式中：A1為樣品或抗壞血酸溶液的測定值；A2為樣品溶液加入2 mL蒸餾水和1 mL無水乙醇后的測定值；A0為空白對照，即2 mL的樣品溶液換為2 mL的H2O后的測定值。

1.3.7.3 ABTS自由基清除率測定

參考文獻[20，21]的方法，稱取0.384 1 g ABTS和0.066 2 g過硫酸鉀，用蒸餾水溶解后定容至100 mL容量瓶中，然后在室溫下于暗處靜置12～16 h。將生成的ABTS自由基溶液用0.01 mol/L pH 7.4的PBS稀釋40～50倍，使其最終在734 nm處的吸光度值為0.70左右。移取1 mL不同濃度的樣品溶液，加入1 mL蒸餾水和2 mL稀釋后的ABTS反應液，振蕩搖勻后在室溫下于暗處靜置6 min，于734 nm處測定吸光度值，ABTS自由基清除能力計算公式如下：

清除率=[1-(A1-A2)/A0]×100%

式中：A1為樣品或抗壞血酸溶液的測定值；A2為樣品溶液加入3 mL蒸餾水后的測定值；A0為空白對照，即1 mL的樣品溶液換為1 mL的H2O后的測定值。

1.4 數據統計分析

每個樣品重復測定3次，用Microsoft Office Excel 2016數據處理軟件求出平均值和標準偏差，數據用均值±標準偏差(x±s)表示。利用SPSS 19.0進行正交實驗設計與方差分析。

2 結果與分析

2.1 豌豆蛋白等電點測定

由圖1可知，豌豆蛋白在pH 4.0～5.0的范圍內沉淀率達到最高值，說明豌豆蛋白的等電點在pH 4.0～5.0的范圍內，在此范圍內，豌豆蛋白的沉淀率先隨著pH的升高而上升，在達到pH 4.2后顯著下降。故豌豆蛋白在pH 4.2時沉淀率達到最大值，此時其蛋白溶解度最小，也就是它的等電點。

圖1 豌豆蛋白等電點

2.2 單因素實驗

2.2.1 提取溫度對豌豆蛋白和多糖提取率的影響

從圖2可以看出，在20～50 ℃范圍內，隨著溫度的上升，由于溶質的擴散動力加大，同時溶液的黏度降低，溶質容易從原料擴散到提取液中，因此蛋白質的提取率隨著提取溫度的升高而增加，但超過50 ℃后可能由于部分蛋白發生變性而使其溶解度降低，提取率出現下降趨勢；多糖的提取率隨著溫度的上升一直增加，當溫度到達40 ℃之后，隨著溫度的上升提取率增加的趨勢趨于穩定，同時考慮到過高溫度對蛋白質變性和多糖糖苷鍵斷裂的影響，綜合兩者的提取率選擇較優的提取溫度為50 ℃。

圖2 提取溫度對豌豆蛋白和多糖提取率的影響

2.2.2 pH對豌豆蛋白和多糖提取率的影響

從圖3結果可以看出，在pH為7.0～9.0的范圍內，蛋白質和多糖的提取率都隨著pH的增大而增大。在pH為9.0時，蛋白提取率達最大，此時蛋白溶解較充分，繼續升高pH，提取率不再增加反而呈現下降趨勢，可能是過強的堿性引起了豌豆蛋白變性。多糖的提取率在pH 9.0～11.0的范圍內基本保持穩定不再增加，綜合兩者的提取率故而選擇較優pH為9.0。

圖3 pH值對豌豆蛋白和多糖提取率的影響

2.2.3 液料比對豌豆蛋白和多糖提取率的影響

圖4結果表明，在液料比20∶1～40∶1 mL/g的范圍內，提取率隨著液料比的增加而增加，可能是因為液料比較小時，提取體系的黏度過大，不利于物料擴散，導致蛋白質溶出速率小，隨著液料比的增加，豌豆粉末與提取液接觸面積越大，蛋白和多糖不斷溶出。當液料比為40∶1 mL/g時，提取率達到最大，料液比繼續增加，提取率不再增加甚至呈現下降趨勢，故選較優液料比為40∶1 mL/g。

圖4 液料比對豌豆蛋白和多糖提取率的影響

2.2.4 提取時間對豌豆蛋白和多糖提取率的影響

圖5結果表明，蛋白質的提取率在提取時間為60 min的范圍內，隨著提取時間的增加而增加，當提取時間超過60 min后，提取率基本不再增加反而出現下降趨勢；多糖的提取率在提取時間到達60 min前快速增長，但在60 min后提取率的增長變化幾乎很小。考慮到在60 ℃的條件下提取時間過長會破壞蛋白質和多糖在溶液中的穩定性，使蛋白發生部分變性而使溶解度降低，使多糖部分降解而使得提取率下降，綜合兩者故選擇較優提取時間為60 min。

圖5 提取時間對豌豆蛋白和多糖提取率的影響

2.3 正交實驗結果與分析

豌豆蛋白和多糖同步提取的正交實驗結果如表2所示，極差分析如表3、表4所示。

表2 正交實驗設計與結果

表3 蛋白提取率極差分析表

表4 多糖提取率極差分析表

分析可知，影響豌豆蛋白提取率的最主要因素為pH，最次要因素為提取時間，主次因素依次為A>D>B>C，最優水平組合為A3B3C3D2；影響豌豆多糖提取率的最主要因素為液料比，最次要因素為提取溫度，主次因素依次為D>C>A>B，最優水平組合為A3B3C1D3。綜合考慮影響蛋白和多糖提取率的主次因素，可以確定A、B、C3個因素的最優水平組合為A3B3C1，因為因素D(液料比)對于蛋白和多糖的提取率都有顯著性的影響，蛋白的最優水平組合中為D2，多糖的最優水平組合中為D3，因此對2個工藝方案A3B3C1D2和A3B3C1D3都進行了驗證，取其中蛋白質和多糖提取率高的為最優工藝方案，得到最優工藝方案為A3B3C1D3，即pH為10.0，提取溫度60 ℃，提取時間30 min，液料比50∶1(mL/g)。

在最優工藝條件下進行3次平行實驗，測得豌豆蛋白提取率為(23.88±0.56)%，多糖提取率為(8.43±0.12)%。

2.4 豌豆蛋白、多糖的得率及純度

2.4.1 豌豆蛋白

采用稱重法計算得到豌豆蛋白的得率為(6.12±0.06)%，使用比色法測定豌豆蛋白凍干樣品的純度為(96.29±0.68)%，對其中的多糖含量也進行了測定，多糖含量為(2.58±0.02)%。

2.4.2 豌豆多糖

采用稱重法計算得到豌豆多糖的得率為(1.75±0.08)%，使用比色法測定豌豆多糖凍干樣品的純度為(27.12±0.15)%。由于純度較低，配制了濃度為1 mg/mL的凍干樣品溶液在紫外下進行了190～700 nm波長范圍下的掃描，所得結果如圖6所示。在210 nm和280 nm波長左右都有較強的紫外吸收，說明多糖樣品中含有蛋白，采用比色法對其中的蛋白含量進行測定，蛋白質量分數為(52.63±0.67)%，可能是因為提取溫度過高使蛋白和多糖發生了美拉德反應[22-23]，因此提取所獲得的凍干樣品實際為糖蛋白樣品，測定其純度為(79.75±0.67)%。

圖6 多糖凍干樣品紫外掃描圖

2.5 抗氧化活性結果與分析

2.5.1 DPPH自由基清除率測定

豌豆蛋白和糖蛋白對DPPH·的清除效果如圖7所示，豌豆蛋白和糖蛋白對DPPH·的清除能力均隨著樣品濃度的增加呈增長趨勢，在質量濃度為1 mg/mL時均達到最大值，蛋白的清除率為10.84%，糖蛋白的清除率為35.08%。在相同的樣品濃度下，糖蛋白對于DPPH·的清除效果比蛋白的清除效果強。

圖7 豌豆蛋白和糖蛋白對DPPH·的清除效果

2.5.2 羥自由基清除率測定

羥自由基(·OH)是活性氧的一種，會使機體產生氧化損傷。豌豆蛋白和糖蛋白對羥自由基的清除效果如圖8所示。豌豆蛋白對羥自由基的清除能力隨著濃度的增加呈快速增長趨勢，在質量濃度達到0.6 mg/mL后，增長趨勢趨于平緩，在質量濃度為1 mg/mL時清除率達到最大值，為40.52%；糖蛋白在質量濃度達到0.8 mg/mL前，其對羥自由基的清除能力隨著質量濃度的增加呈快速增長趨勢，在質量濃度達到0.8 mg/mL后，增長趨勢基本趨于穩定，在質量濃度為1 mg/mL時清除率達到最大值，為34.53%。在樣品質量濃度小于0.4 mg/mL時，糖蛋白對羥自由基的清除能力優于蛋白；但當樣品質量濃度大于0.4 mg/mL時，蛋白對羥自由基的清除能力更強。

圖8 豌豆蛋白和糖蛋白對·OH的清除效果

2.5.3 ABTS自由基清除率測定

豌豆蛋白和糖蛋白對ABTS自由基的清除效果如圖9所示，蛋白樣品對ABTS自由基的清除能力隨著質量濃度的增加呈持續增長趨勢，在質量濃度為1 mg/mL時清除率達到最大值90.42%；糖蛋白樣品的清除能力在質量濃度達到0.6 mg/mL之前隨著質量濃度的增加而增加，當質量濃度大于0.6 mg/mL時，其對ABTS自由基的清除率基本保持穩定，并在1 mg/mL時達到最大值98.74%。

圖9 豌豆蛋白和糖蛋白對ABTS+·的清除效果

3 結論

通過優化得到的同步提取工藝為：pH為10，提取溫度60 ℃，提取時間30 min，液料比50∶1(mL/g)，此工藝下蛋白提取率可達到(23.88±0.56)%，多糖提取率為(8.43±0.12)%。獲得的蛋白純度達到了(96.29±0.68)%，得率為(6.12±0.06)%；由于發生美拉德反應，同步提取得到的另一個產品為糖蛋白，純度為(79.75±0.67)%，得率為(1.75±0.08)%。

抗氧化實驗中，豌豆蛋白和糖蛋白均具有一定的抗氧化活性，且在大多數情況下，同濃度的糖蛋白溶液的抗氧化能力要強于蛋白溶液，糖蛋白可能具有廣闊的發展前景。