超聲波輔助酶法提取沙棘果油及其體外抗氧化能力分析

劉 儉 蔡永國 張 兵 歐陽韶 楊海燕，3

(新疆農業大學食品科學與藥學學院1，烏魯木齊 830052) (新疆慧華沙棘生物科技有限公司2，阿勒泰 836200) (新疆沙棘工程技術研究中心3，烏魯木齊 830000)

沙棘(HippopherhamnoidsL.)為胡頹子科沙棘屬灌木，又名醋柳、黑刺等[1]，廣泛分布于歐亞的溫帶地區[2]。我國沙棘資源豐富，總面積達3000萬畝[3]，占世界沙棘總面積的95%，且以肋果沙棘和中國沙棘亞種分布居多[4]。沙棘鮮果富含多糖、蛋白質、氨基酸、維生素、黃酮類化合物及不飽和脂肪酸等[5]，沙棘果油(本研究僅指鮮果果油)是沙棘果實天然生物活性成分的精華，具有抗輻射、抗衰老、抗潰瘍、降血脂和增強免疫力等藥理功效[6]，被廣泛應用于醫藥、食品和化妝品等領域[7]。

目前直接從沙棘鮮果中提取沙棘果油的方法主要有酶法[8]、壓榨離心法[9]和有機溶劑萃取法[10]等。與傳統提油工藝相比，酶法提油條件溫和，能夠最大限度保留活性成分，且其所需設備簡單，滿足食用油脂生產“安全、高效、營養、綠色”的原則[11]。UAE提取技術在近年來發展迅速，張妍[12]等提取菜籽油，發現UAE提取油脂得率可達67.55%，明顯優于單一酶法提取。超聲波在液體中可以產生機械效應、空化作用以及熱效應等[13]，破壞細胞壁，進而暴露更多的酶促位點[14]，與酶法結合進行酶解反應，能夠極大地縮短酶法提取時間和提高產品得率。有關UAE提油的研究較多，張偉光[15]等采用超聲波輔助蛋白酶法提取冬瓜籽油，在最優條件下冬瓜籽油的提取率可達82.55%，比優化前高10.06%；徐君飛等[16]從茶葉籽中提油，發現UAE提取工藝在最佳條件下，茶葉籽出油率為(52.61±0.11)%。

顧晶晶[17]采用超聲波預處理沙棘原漿，超聲功率200 W、超聲時間10 min，然后加入酶制劑進行酶解提油，發現超聲波預處理對酶法提取沙棘果油沒有幫助。然而關于UAE提取沙棘果油鮮有報道，本研究基于此出發點以沙棘鮮果為原料，采用UAE提取沙棘果油。首先在單因素試驗的基礎上，通過響應面優化復合酶制劑的比例，然后利用單因素與正交試驗對沙棘果油的提取工藝進行優化，旨在降低沙棘果油的提取成本和提高果油得率；同時運用GC對沙棘果油的脂肪酸組成進行分析，并測定沙棘果油的體外抗氧化能力，以期為UAE提取高品質的沙棘果油的工業化提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 材料與試劑

沙棘鮮果：2017年10月采摘于新疆青河縣，-18 ℃低溫凍存至6月份實驗；果膠酶：最適pH 3.5～4.0，最適溫度50 ℃，酶活力500 U/mg；纖維素酶：pH 4.8～5.0，50 ℃，酶活力≥50 U/mg；酸性蛋白酶：pH 2.5～4.0，40～50 ℃，酶活力≥50 U/mg。其他試劑均為國產分析純。

1.1.2 儀器與設備

TC-1056破壁養生調理專家；TDL-5-A低速大容量離心機；5417R小型臺式冷凍型離心機；KQ-250DE數控超聲波清洗器；SZF-06A脂肪測定儀；GC-2014氣相色譜儀；UV-1200紫外可見分光光度計。

1.2 試驗方法

1.2.1 沙棘果油提取工藝流程

沙棘凍果→解凍(水溫60 ℃、時間1 min)→打漿過濾→沙棘原漿→調節pH→超聲酶解→離心分離(4 000 r/min離心20 min)→上層果油粗品→二次離心(8 000 r/min離心10 min )→沙棘果油

1.2.2 沙棘原漿基本指標的測定

水分的測定：GB 5009.3—2016直接干燥法；可溶性固形物：使用PAL-1數字手持袖珍折射儀進行測定，結果以°Brix計；pH：使用PHS-3C PH計進行測定；粗脂肪的測定：GB 5009.6—2016索氏抽提法；粗蛋白的測定：GB 5009.5—2016凱氏定氮法；總酸：GB/T 12456—2008酸堿滴定法，結果以蘋果酸計(沙棘原漿主要的有機酸之一[18])。

1.2.3 沙棘果油得油率計算

沙棘果油得油率和提取率的計算公式：

(1)

式中：m為果油質量/g；M為沙棘原漿的質量/g。

(2)

式中:W為沙棘原漿粗脂肪含量。

1.2.4 復合酶制劑比例的篩選

1.2.4.1 單一酶添加量的單因素試驗

選擇果膠酶、纖維素酶、酸性蛋白酶添加量進行單因素試驗，固定酶解時間4 h、超聲功率150 W，考察三種酶在其最適酶解環境下，添加量梯度(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0)%對沙棘果油得油率的影響。

1.2.4.2 復合酶制劑比例的優化試驗

根據單因素試驗的結果，設置酶解的條件為：超聲功率150 W、酶解時間4 h、酶解溫度50 ℃和pH 4.0。選取果膠酶添加量(A)，纖維素酶添加量(B)，酸性蛋白酶添加量(C)作為試驗因素，以沙棘果油得油率(Y)為響應值，采用Design-Expert 10.0.3軟件，根據Box-Behnken試驗設計原理，優化復合酶制劑比例，試驗因素與水平見表1。

表1 響應面試驗的因素與水平

1.2.5 提取工藝的優化

1.2.5.1 單因素試驗

采用單因素試驗，考察不同的超聲功率(100、125、150、175、200)W、超聲酶解時間(2、3、4、5、6)h、pH(3.0、3.5、4.0、4.5、5.0)和復合酶總添加量(0.6、0.9、1.2、1.5、1.8)%對沙棘果油得油率的影響。

1.2.5.2 正交優化試驗

在單因素試驗的基礎上，選取超聲功率、超聲酶解時間、pH和復合酶總添加量一共4個因素，按照L9(34)的正交表進行正交試驗。探究UAE提取沙棘果油工藝優化的參數。

表2 正交試驗的因素與水平

1.2.6 GC分析沙棘果油脂肪酸組成

根據GB 5009.168—2016《食品安全國家標準 食品中脂肪酸的測定》中第三法歸一化法進行測定[19]。

1.2.7 沙棘果油活性成分的測定

黃酮：參照Sharif等[20]方法進行測定；維生素E：參照Cenkowski等[21]的方法進行測定；類胡蘿卜素：參照楊萬政等[22]的方法進行測定。

1.2.8 沙棘果油體外抗氧化能力的測定

·OH清除能力的測定：參照Hifney等[23]的方法進行測定。ABTS+·清除能力的測定：參照Li等[24]的方法進行測定。

1.3 數據分析

數據處理和統計分析使用Excel和SPSS 21.0軟件，作圖采用Origin 8.5軟件，使用Design-Expert 10.0.3軟件進行Box-Behnken響應面分析和Taguchi OA試驗設計。

2 結果與分

2.1 沙棘原漿的主要成分

對制得的沙棘原漿立即進行理化指標的測定，其測定結果見表3。

表3 沙棘原漿的主要成分

2.2 復合酶制劑比例的確定

2.2.1 單一酶添加量的單因素試驗結果

圖1 單一酶添加量對沙棘果油得油率的影響

2.2.2 復合酶制劑比例的優化試驗結果

基于單因素試驗，利用響應面分析法優化復合酶制劑的比例，進行三因素三水平的響應面試驗。具體試驗設計及結果見表4。

表4 Box-Behnken試驗設計及結果

表5 Box-Behnken試驗結果二次回歸方差分析

注：P<0.01，極顯著(**)；P<0.05，顯著(*)。

2.3 UAE提取工藝的優化

2.3.1 單因素試驗結果

圖2 不同因素對沙棘果油得油率的影響

由圖2可知，在酶法提取沙棘果油的過程中施加超聲波，當超聲功率為100～125 W時，得油率不斷升高，在超聲功率125 W時達到最高。這是因為超聲波的機械振動和空化作用能夠破壞細胞組織，促進胞內物質的釋放，酶解與之結合能夠大大提高果油得率[27]。當超聲功率大于125 W時，沙棘果油得率開始下降；當超聲功率在200 W時，甚至低于對照組(0 W)，這與較高的超聲功率導致酶活降低或部分喪失有關[28]。隨著超聲酶解時間的延長，沙棘果油得率不斷提高，在超聲酶解時間2～3 h時，得油率上升幅度較大，當時間超過3 h后，得油率基本保持不變。這是由于酶解效率隨著時間的延長逐漸提高，油脂釋放就會越多，但是繼續延長時間，酶解反應會因為底物減少以及產物增多而受到抑制。隨著pH升高，沙棘果油得油率先增加后減小，當pH為3.5時，得油率最高為3.424%。這是因為酶不在最適pH條件下，其活性會受到抑制，導致得油率下降。當復合酶總添加量為0.6～1.2%時，沙棘果油得率隨著酶添加量的增多不斷升高，繼續增加復合酶總添加量，得油率變化不大。

2.3.2 工藝的優化試驗結果

由表6可知，正交試驗結果最優組合為2號(X1-1X2-2X3-2X4-2)，得油率為3.465%，各因素對沙棘果油得油率的影響主次順序為X4(復合酶添加量)>X1(超聲功率)>X3(pH)>X2(超聲酶解時間)，最優工藝的水平組合為X1-2X2-2X3-2X4-2。對其進行驗證試驗，沙棘果油得油率為(3.494±0.025)%，優于正交試驗2號。因此選擇X1-2X2-2X3-2X4-2作為UAE提取沙棘果油的最佳工藝，即超聲功率125 W、超聲酶解時間3 h、pH 3.5和復合酶添加量1.2%，超聲酶解溫度50 ℃，在此工藝下的沙棘果油得油率為(3.494±0.025)%，提取率為83.9%。

表6 正交試驗結果

2.4 沙棘果油的脂肪酸組成及其活性成分分析

2.4.1 脂肪酸組成分析

據查國立北平師范大學始建于1902年京師大學堂(師范館)，后經多次大學演變于1931年7月北平師范大學與北平女子師范大學合并，定名國立北平師范大學。1932年經教育部正式批準改為國立北平師范大學。1937年7月，盧溝橋事變后，北平師范大學遷往西安，與國立北平大學、國立北洋工學院組成西安臨時大學。1938年春，西安臨時大學遷至漢中，改名為國立西北聯合大學，北平師大改為西北聯大教育學院。同年8月，西北聯合大學教育學院改為師范學院，后改稱國立西北師范學院。

采用GC分析UAE提取的沙棘果油脂肪酸組成，由表7可知，沙棘果油的脂肪酸被檢測出13種，主要脂肪酸為棕櫚酸、棕櫚油酸和亞油酸。不飽和脂肪酸共有6種，含量高達60.596 1%，分別為棕櫚油酸、順-10-十七碳一烯酸、油酸、亞油酸、α-亞麻酸和神經酸，其中棕櫚油酸含量達到43.389 9%，亞油酸含量為11.266 5%。棕櫚油酸具有降低血脂，預防動脈硬化和緩解糖尿病、脂肪肝等慢性疾病的功效[29]；亞油酸是人體必需脂肪酸，具有增強機體免疫能力，防治動脈粥樣硬化和老年性肥胖癥等功效[30]，由此可知沙棘果油具有極高的營養價值和經濟價值。

表7 沙棘果油的脂肪酸組成與相對含量

2.4.2 活性成分分析

表8可見，采用UAE提取的沙棘果油含大量活性成分，其黃酮含量為(62.88±0.26) mg/100 g，維生素E含量為(150.35±0.08) mg/100 g，類胡蘿卜素含量為(14.66±0.32) mg/100 g。

表8 沙棘果油的活性成分

2.5 沙棘果油體外抗氧化能力研究

2.5.1 沙棘果油清除·OH能力

圖3 對·OH的清除率

羥自由基廣泛存在于生物體內，是一種細胞毒性很強的自由基，能使胞內的蛋白質、核酸等物質出現損傷，從而引發各種疾病和機體衰老，且其反應極快[31]。由圖3可知，隨著質量濃度的增大，沙棘果油和VC清除·OH的能力幾乎呈線性上升，其清除·OH的IC50分別為179.33 μg/mL和122.62 μg/mL，VC的·OH清除能力是沙棘果油的1.46倍。結果表明，沙棘果油清除·OH的能力較強，略弱于VC。

2.5.2 沙棘果油清除ABTS+·能力

由圖4可知，在質量濃度為4～12 mg/mL時，沙棘果油的ABTS+·清除能力呈現線性上升的趨勢，由41.26%～95.25%，之后趨于平緩。VC對ABTS+·的清除能力基本維持在99%左右，表明質量濃度為12 mg/mL的沙棘果油與VC的ABTS+·清除能力相近。沙棘果油對ABTS+·清除作用的IC50=5.54 mg/mL。

圖4 對ABTS+·的清除率

3 討論

通過測定UAE提取的沙棘果油脂肪酸組成、活性成分及其體外抗氧化能力，結果證明沙棘果油富含不飽和脂肪酸，是一種營養價值極高的植物油脂，同時具有較強的抗氧化能力。目前直接從沙棘鮮果中提取沙棘果油的方法主要有酶法、壓榨離心法和有機溶劑萃取法等。李煒等[9]采用壓榨離心法提取沙棘果油，溫度60 ℃、8 000 r/min離心10 min，工藝簡單但是得油率不足1%，提取率為35.6%。采用UAE提取沙棘果油，超聲功率125 W、超聲酶解時間3 h、pH 3.5和復合酶添加量1.2%，超聲酶解溫度50 ℃，在該條件下的沙棘果油得油率可達3.5%，提取率為83.9%。沙棘果實的細胞壁主要由果膠、纖維素和半纖維素等物質組成[32]，沙棘果油在果實兩端和細胞質的網絡結構中，以脂蛋白、脂多糖等形式存在[33]。選擇果膠酶、纖維素酶和酸性蛋白酶復配，能使細胞壁與胞內網絡結構酶解更加徹底，提高沙棘果油的得油率。酶法提油反應條件溫和，結合超聲波輔助處理可以大大減少酶解時間，本實驗中，超聲酶解時間3 h，較康健等[32]縮短50%，較汪曉琳[34]縮短29.2%，最大限度地保持了沙棘原漿風味和保留沙棘天然活性成分。沙棘原漿經UAE提取沙棘果油后，采用液體超微化粉粹、超高壓均質勻漿、脫氣和殺菌灌裝將果漿加工成沙棘濁汁[35]，此種方法能夠增加單位原料價值，為企業經濟效益的提高提供了技術支撐。

4 結論

采用單因素結合響應面試驗對復合酶的比例進行優化，得到最優添加量比例為果膠酶∶纖維素酶∶酸性蛋白酶=0.675%∶0.424%∶0.508%。通過單因素與正交試驗對沙棘果油的UAE提取工藝進行優化，獲得最優的工藝為超聲功率125 W、超聲酶解時間3 h、pH 3.5和復合酶添加量1.2%，超聲酶解溫度50 ℃，該條件下沙棘果油得油率為(3.494±0.025)%，提取率為83.9%。運用GC對沙棘果油的脂肪酸組成進行分析，沙棘果油的脂肪酸被檢測出13種，主要為棕櫚酸、棕櫚油酸和亞油酸。不飽和脂肪酸共有6種，含量高達60.596 1%，分別為棕櫚油酸、順-10-十七碳一烯酸、油酸、亞油酸、α-亞麻酸和神經酸，其中棕櫚油酸含量達到43.389 9%，亞油酸含量為11.266 5%。沙棘果油的黃酮含量為(62.88±0.26)mg/100 g，維生素E含量為(150.35±0.08)mg/100 g，類胡蘿卜素含量為(14.66±0.32) mg/100 g。同時，體外抗氧化能力的測定結果表明沙棘果油具有較強的體外抗氧化能力。