凝血酶激活纖溶抑制物基因CPB2單核苷酸多態性與不明原因復發性流產的關系

李曉慶 徐曉敏

正常生理性高凝狀態下的凝血-纖溶系統精確調控對正常的胚胎植入和滋養層細胞侵襲具有重要作用，而凝血機制異常可能是導致不明原因復發性流產（unex原plained recurrent spontaneous abortion，URSA）的原因之一[1-2]。有研究表明，血液凝血酶激活纖溶抑制物（thrombin-activatable fibrinolysis inhibitor,TAFI）水平與早期URSA的發生呈負相關，高水平TAFI可降低早期URSA發生的風險[3-4]。TAFI是由羧肽酶B2（carboxypep原tidase B2，CPB2）基因編碼并調控凝血-纖溶平衡的羧肽酶原，其功能主要為：（1）TAFI被凝血酶、凝血酶-血栓調節蛋白復合體或纖溶酶激活后，降解纖維蛋白C端賴氨酸殘基以抑制纖溶酶介導的纖溶系統[1，3]；（2）血小板聚集后，血小板源性TAFI在血栓內部發揮抗纖溶作用[5]；（3）激活后的TAFI可抑制纖溶和凝血系統引起的下游免疫反應，并抑制胎盤滋養細胞凋亡[6]。目前，已有的CPB2單核苷酸多態性（single nucleotide polymor原phisms，SNPs）檢測研究結果顯示，位點如 rs2146881（-438G＞A）、rs3742264（505A＞G）和 rs1926447（1040C＞T）與血漿TAFI水平和纖溶活性相關，且在URSA患者和正常人群中的分布具有顯著差異[7-9]。本研究對溫州地區女性人群中URSA患者及正常妊娠者TAFI編碼基因CPB2SNPs進行基因型分析，探討CPB2SNPs與URSA的關系。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2015年1月至2016年12月在溫州市人民醫院就診并診斷為URSA的96例患者作為URSA組。納入標準：（1）夫婦雙方均為溫州地區人，既往體健，無家族遺傳病史；（2）女方為生育期婦女，常規行超聲、內分泌、抗卵磷脂抗體、抗子宮內膜抗體、染色體、傳染病檢查結果均正常，符合URSA診斷標準[10]；（3）男方精液常規、DNA碎片分析及傳染病檢查結果均正常。另以103例同期在我院健康體檢的女性作為對照組。納入標準：（1）夫婦雙方均為溫州地區人，既往體健，無家族遺傳病史；（2）女方為生育期婦女，成功分娩一胎以上，無自然流產史，常規行超聲、內分泌、抗卵磷脂抗體、抗子宮內膜抗體、染色體、傳染病檢查結果均正常；（3）男方無傳染性疾病。排除兩組蛋白C、蛋白S、抗凝血酶芋水平異常，以及已知血栓相關SNPs位點、凝血因子吁 G1691A Leiden、凝血因子域 G20210 A和MTHFR C677T突變。隨訪并記錄患者纖維蛋白原（FIB）、D-D二聚體（D-Dimer）和血小板最大聚集率（PAgT）中 PAgT（ADP）、PAgT（AA）水平。本研究經溫州市人民醫院倫理委員會同意，受試者簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 一般資料比較 收集兩組對象的一般資料并進行比較，包括年齡、BMI、妊娠史、流產史，以及有無孕期乙肝病毒攜帶、子宮肌瘤、瘢痕子宮、甲狀腺功能減退癥、癲癇、心血管系統疾病、膽道系統疾病史。

1.2.2 基因組DNA提取 抽取外周靜脈血2ml，采用血液基因組DNA提取試劑盒（德國凱杰公司）提取全血DNA，保存于-80益。

1.2.3 URSA相關基因目標區域捕獲和測序 目標捕獲芯片設計及測序由深圳華大基因科技服務有限公司完成。去除接頭污染和低質量數據后，采用SAMtools（http://samtools.sourceforge.net/）、GenomeAnalysisTK（https://software.broadin stitute.org/gatk/）分析樣本突變位點，篩選基因分型率＞90%且位點覆蓋度＞10reads為可信SNPs位點。通過 dbSNP（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/）和 HapMap數據庫（http://www.internation原algenome.org/category/hapmap）對位點注釋，并采用基質輔助激光解析電離飛行時間質譜對SNPs位點進行驗證。探針設計及位點檢測由深圳華大基因科技服務有限公司MassARRAY平臺完成。

1.3 統計學處理 采用SPSS 21.0統計軟件。計量資料用表示，組間比較采用t檢驗；計數資料用率表示，組間比較采用x2檢驗，1＜理論頻數（T）＜5時采用連續性校正的x2檢驗，T＜1時采用Fisher確切概率法檢驗。Hardy-Weinberg平衡定律吻合度檢驗、兩組基因型和等位基因頻率分布比較均采用x2檢驗；關聯分析采用95%可信區間（CI）的比值比（OR）表示，并采用 B onferroni法和FDR法對結果進行多重檢驗校正。URSA患者不同CPB2SNPs 基因型間 FIB、D-Dimer、PAgT（ADP）和PAgT（AA）差異比較采用Mann-WhitneyU秩和檢驗。檢驗水準設為琢=0.05，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般資料 兩組間除妊娠次數和流產次數外，其他一般資料的差異均無統計學意義（均P＞0.05），詳見表1。部分混雜因素在兩組中無分布。

表1 兩組一般資料的比較

2.2 CPB2 SNPs基因型和等位基因頻率分布 6個已知SNPs位點（rs2296642、rs3742264、rs7337140、rs9316179、rs2277440、rs1926447）在兩組中存在多態性且分布符合Hardy-Weinberg平衡（P＞0.05）。URSA組rs2296642（檢驗效能為0.649）等位基因C、rs3742264（檢驗效能為0.873）等位基因 A、rs7337140（檢驗效能為 0.630）等位基因G和rs9316179（檢驗效能為0.844）等位基因C頻率分別低于對照組。經Bonferroni法和FDR法多重檢驗校正，rs3742264和rs9316179等位基因和基因型頻率分布兩組間的差異均有統計學意義（均P＜0.05），詳見表2。

表2 URSA組與對照組CPB2 SNPs基因型/等位基因分布

2.3 CPB2 SNPs連鎖不平衡分析 rs2296642-rs7337140（D憶=0.91，r2=0.83）和 rs3742264-rs9316179（D憶=1，r2=0.98）為強連鎖不平衡（D憶＞0.9，r2＞0.33）。URSA 組基因型組合rs3742264-rs9316179:GGTT頻率顯著高于正常組（61.5% vs 39.8%，OR=2.411，95%CI：1.364-4.263，x2=9.318，校正后P＜0.05），詳見表 3。

表3 URSA組與對照組CPB2 SNPs連鎖基因型組合分析

2.4 URSA組CPB2SNPs不同基因型間血栓指標差異分析 rs3742264 GG攜帶者PAgT（ADP）水平為78.0（72.8～83.6）%，分別低于rs3742264 GA和AA攜帶者的 81.7（76.5～86.8）%和 82.65（78.80～86.50）%，攜帶一個或兩個A等位基因與非攜帶者PAgT（ADP）水平差異有統計學意義（P=0.037）（圖1）。rs3742264不同基因型間FIB、D-Dimer和PAgT（AA）的差異均無統計學意義（均P＞0.05）。其他SNPs不同基因型間FIB、D-Dimer、PAgT（ADP）和PAgT（AA）的差異均無統計學意義（均P＞0.05）。

圖1 URSA組不同rs3742264基因型患者PAgT（ADP）水平的比較

3 討論

正常妊娠過程引起的生理性高凝狀態將增加血栓形成風險，在這一狀態下的凝血機制異常引起的胎盤微血栓和胎盤功能障礙可導致URSA，而TAFI對局部凝血-纖溶系統精確調控至關重要[1，9]。在血栓調節蛋白的活化作用下，TAFI介導的纖溶抑制和蛋白C介導的凝血抑制可精確調控凝血功能，并共同抑制血栓導致的下游炎癥反應，且TAFI的纖溶抑制調控僅作用于局部，對血栓外的正常凝血功能無顯著影響[6，11]。Knol等[3]和Legnani等[4]分別對荷蘭與意大利URSA與血漿TAFI相關性分析表明，早期URSA患者中TAFI水平顯著低于正常人群，指出高濃度TAFI可降低URSA發病風險。ElDanasori等[9]對早期妊娠人群TAFI功能研究發現，除調控妊娠期凝血-纖溶平衡外，低纖溶狀態下的高濃度水平TAFI可抑制纖維蛋白降解產物的形成，減少胎盤滋養細胞的凋亡，有利于正常妊娠，尤其是早期妊娠。目前，較多CPB2基因突變位點及多態性位點已被證明與TAFI活化、催化活性、失活及血栓疾病發生等密切相關[6-8]。

本研究采取嚴格的選取標準，采用目標序列捕獲測序方法和飛行質譜法，對溫州地區人群中96例URSA女性和103例正常妊娠史女性CPB2基因測序分析表明，rs3742264和rs9316179等位基因和基因型頻率分布在兩組間差異顯著（Bonferroni＜0.05，FDR＜0.05），rs3742264 A（OR=0.490）和 rs9316179 C（OR=0.506）與URSA的發生呈負相關，具有保護作用。攜帶rs3742264-rs9316179 GGTT（OR=2.411）女性URSA發病風險顯著高于正常女性。其中，rs3742264（505G＞A）導致Ala147Thr錯義突變，rs9316179（678T＞C）為同義突變（SIFT和Polyphen2預測為良性突變），rs3742264和rs9316179為強連鎖不平衡（D憶＞0.9，r2＞0.33），因此，我們認為強連鎖導致rs9316179在兩組分布差異，而rs9316179并不具有臨床效應。Arauz等[12]發現CPB2基因多態性的改變能夠機體的凝血和纖溶狀態，人體內TAFI的水平與基因多態性有緊密的聯系。Santos等[13]和Wang等[14]對血栓患者的研究表明，rs3742264（505G＞A）與血漿TAFI水平具有顯著相關性，攜帶rs3742264等位基因A人群TAFI水平顯著高于攜帶G位點人群。而Masini等[7]對意大利URSA人群CPB2基因的5個高TAFI水平相關SNPs位點檢測發現，505G＞A和1583A＞T與URSA的發生呈負相關，攜帶rs3742264等位基因A可顯著提高血漿TAFI水平，并降低URSA發病率。而我們分析rs3742264與URSA患者血栓相關指標發現，rs3742264 GG患者PAgT（ADP）水平顯著低于rs3742264 GA和AA患者。外周血TAFI分為血漿源性TAFI和血小板源性TAFI。Urano等[5]對血小板源性TAFI功能的綜述提示，血小板源性TAFI可促進血小板聚集并在血栓內部迅速積聚以抑制血栓溶解。而Dempsey等[15]分析復發性流產患者4-7周的血小板功能后指出，再次妊娠失敗的URSA患者PAgT（ADP）水平顯著低于再次妊娠成功的URSA患者。據此，我們猜測rs3742264等位基因A可維持正常血漿TAFI水平和血小板功能，有利于正常妊娠。

綜上所述，我們對溫州地區URSA女性CPB2基因的SNPs分析發現，TAFI與URSA具有相關性。但由于本研究樣本量較小（部分位點檢驗效能小于0.8），一方面需要加大樣本量對實驗結果進行驗證，另一方面需要檢測突變基因攜帶人群TAFI水平，觀察基因突變是否影響TAFI抗纖溶功能，從而為溫州地區臨床URSA治療提供可靠依據。