兩例嵌合Y染色體長臂大片段缺失的產(chǎn)前診斷及文獻(xiàn)回顧分析

徐丹萍 戴美珍 管荷琴 阮琰 王珺 陳雪君 諸溢揚(yáng)

性腺的分化源自于胚胎初期的性染色體，而Y染色體在胎兒性腺發(fā)育成男性過程中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用。其中位于Y染色體短臂臨近末梢位置的SRY基因（sex-determining region Y）就是睪丸決定因子之一。Y染色體的結(jié)構(gòu)異常表現(xiàn)為Y染色體的斷裂及其衍生后的異常：缺失、重復(fù)、易位、環(huán)狀染色體和等臂雙著絲粒染色體。然而經(jīng)典細(xì)胞遺傳學(xué)核型分析無法識別Y染色體長臂大片段缺失，將其認(rèn)為是一種結(jié)構(gòu)異常的標(biāo)記染色體（marker chromosome，mar）。在圍生期發(fā)現(xiàn)胎兒mar的重要性在于通過其所保留和丟失的遺傳基因，以及這些基因在胚胎生長發(fā)育過程中所要發(fā)揮的作用，這將更有利于提前預(yù)判胎兒表型的變化。本研究聯(lián)合應(yīng)用多種技術(shù)對兩例嵌合Y染色體長臂大片段缺失的胎兒進(jìn)行產(chǎn)前診斷，并回顧國內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行匯總分析，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料和方法

1.1 一般資料 例1：女，36歲，G4P1，第一胎女兒已8歲，生長發(fā)育正常。孕婦因高齡在孕16周行母親外周血游離DNA（NIPT）檢測，結(jié)果提示性染色體異常。在孕20周行羊水穿刺，羊水細(xì)胞染色體核型分析。夫妻雙方與第一個女兒的外周血染色體核型均正常。三維B超檢查胎兒未發(fā)現(xiàn)明顯異常（無宮內(nèi)發(fā)育遲緩，男性，陰莖正常大小）。 例2：女，22歲，G1P0，孕晚期（29周）因B超檢查提示胎兒多囊腎及胎兒宮內(nèi)發(fā)育遲緩就診，唐氏綜合征篩查顯示為低風(fēng)險(xiǎn)。由于孕周過大而無法行細(xì)胞遺傳學(xué)核型分析，僅行熒光原位雜交（FISH）和二代測序法檢測。夫妻雙方外周血染色體核型均正常。B超檢查該胎兒未發(fā)現(xiàn)陰莖，引產(chǎn)胎兒表型為女性。

1.2 方法 患者簽署知情同意書后，在超聲定位及引導(dǎo)下，采集羊水細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞遺傳學(xué)核型分析、FISH及二代測序法檢測。

1.2.1 細(xì)胞遺傳學(xué)核型分析 羊水細(xì)胞經(jīng)離心后接種到羊水培養(yǎng)瓶中，放入37益二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，第7天換液后留懸浮細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)，常規(guī)收獲貼壁細(xì)胞，胰酶消化后行G顯帶。

1.2.2 FISH 選用產(chǎn)前診斷染色體檢測試劑盒（北京金菩嘉公司）中CSPX探針（綠色，定位于Xp11.1-q11.1）和CSPY探針（紅色，定位于Yp11.1-q11.1），滴加于預(yù)雜交區(qū)域，按說明書進(jìn)行常規(guī)操作。

1.2.3 二代測序法 常規(guī)提取羊水細(xì)胞DNA，按北京博奧公司提供的操作手冊進(jìn)行片段化酶切、建庫、純化、定量、乳液PCR、產(chǎn)物富集、上機(jī)等，之后用軟件進(jìn)行全基因組拷貝數(shù)分析。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞遺傳學(xué)核型分析 計(jì)數(shù)分析100個羊水細(xì)胞分裂相，發(fā)現(xiàn)例1羊水細(xì)胞存在嵌合體，少了一條性染色體，多了一個mar，染色體核型為：45,X[9]/46,X,+mar[91]，見圖 1。

圖1 例1羊水細(xì)胞染色體核型46,X,+mar

2.2 FISH 兩例胎兒羊水細(xì)胞FISH結(jié)果均提示Y染色體存在大片段缺失，具體缺失長度未知且均存在嵌合，嵌合比例分別為90%（圖2a）和50%（圖2b）。

圖2 兩例胎兒羊水細(xì)胞FISH結(jié)果（a：例1，b：例2）

2.3 二代測序法 羊水細(xì)胞二代測序法結(jié)果提示，例1為45,XO[10]/46,XY,del(Yq11.221-q11.23).[GRCH37/hg19]（17.32Mb-28.78Mb）[90]，例2為45,XO[50]/46,XY,del（Yq11.222-q11.23）.[GRCH37/hg19]（20Mb-28.78Mb）[50]，兩份羊水細(xì)胞均存在XO嵌合體，但嵌合比例不同，見圖3。

圖3 兩例胎兒羊水細(xì)胞Y染色體二代測序圖和所有染色體拷貝數(shù)水平（a：例1的Y染色體17.32Mb-28.78Mb存在缺失，且Y染色體比X染色體拷貝數(shù)低10%左右；b：例2的Y染色體20Mb-28.78Mb存在缺失，且Y染色體比X染色體拷貝數(shù)低50%左右）

2.4 妊娠結(jié)局 在告知上述結(jié)果后，例1孕婦于孕24周、例2孕婦于孕31周中止妊娠，引產(chǎn)兒外表無殊，例2女嬰僅生長發(fā)育遲緩，其家屬均拒絕作進(jìn)一步的病理檢查。

3 討論

mar的發(fā)生率相當(dāng)?shù)停谛律鷥褐写蟾艦?.001%，產(chǎn)前診斷的檢出率大概為0.004%。1977年Kaluzewski等報(bào)道了1例24歲男性患者，因外生殖器發(fā)育不全，缺少右側(cè)睪丸就診，核型分析結(jié)果顯示45,X/46,XX/46,X,+mar/47,XX,+mar，認(rèn)為此mar可能為Y染色體。自此，隨著研究的進(jìn)一步深入，越來越多學(xué)者關(guān)注Y染色體長臂大片段缺失對人體的影響。

在本研究中，例1孕婦羊水細(xì)胞中存在2種細(xì)胞：45,X和46,X,+mar，mar的嵌合比例達(dá)91%，通過FISH及二代測序法確定該mar為Y染色體，且存在大片段缺失。二代測序法僅對功能區(qū)域進(jìn)行測序，結(jié)果提示45,XO[10]/46,XY,del（Yq11.221-q11.23）.[GRCH37/hg19](17.32Mb-28.78Mb)[90]，換言之，2.6Mb-17.32Mb 的功能區(qū)域均存在，從而表明SRY基因（Y：2654896bp-2652894bp）、AZF（azoospermia factor）區(qū)域 a（Y：14.35Mb-15.15Mb）完整存在，而 AZFb（Y：20.11Mb-26.07Mb）和 AZFc（Y：24.98Mb-28.03Mb）則完全缺失。三維B超顯示胎兒為男性，不存在宮內(nèi)發(fā)育遲緩的現(xiàn)象，且男性陰莖正常大小。例2孕婦羊水細(xì)胞二代測序法結(jié)果為45,XO[50]/46,XY,del(Yq11.222-q11.23).[GRCH37/hg19]（20Mb-28.78Mb）[50]，同樣SRY基因和AZFa區(qū)域完整存在，而AZFb和AZFc區(qū)域完全缺失，引產(chǎn)嬰兒表型為女性，且B超檢查顯示胎兒存在宮內(nèi)發(fā)育遲緩現(xiàn)象及多囊腎。

以往文獻(xiàn)報(bào)道，在明確嵌合Y染色體長臂大片段缺失的病例中，患者社會性別比例（男頤女）為15頤10，大部分男性患者存在正常陰莖但伴有尿道下裂，大部分女性患者存在原發(fā)性閉經(jīng)；有6例女性患者進(jìn)行SRY基因檢測，5例（83.3%）SRY基因表達(dá)陽性，其性別可能與Y染色體嵌合有關(guān)[1-3]。外周血白細(xì)胞中Y染色體嵌合比例越高成為男性的概率越高，XO嵌合比例越高則成為女性的概率越大，但也有例外[4-5]。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)這些例外可能與組織嵌合相關(guān)，如Petrusevska等[4]報(bào)道的1例女性患者，外周血白細(xì)胞中Y染色體長臂大片段缺失嵌合比例高達(dá)90%（血液源自內(nèi)胚層），而其皮膚組織嵌合比例低于10%（皮膚源自外胚層）及性腺組織嵌合比例在11%～31%之間（性腺源自中胚層），從而表明胚胎在發(fā)育過程中由于不同胚層的嵌合比例不同，從而影響胚胎性別發(fā)育。并有文獻(xiàn)報(bào)道，Y染色體關(guān)鍵區(qū)域（AZFa、AZFb和AZFc）的重要基因?qū)δ行孕韵偕删悠鸬绞种匾淖饔茫渫耆笔Щ虿糠秩笔Э蓪?dǎo)致性腺萎縮或無法生成精子；8例成年男性均存在不育史，2例（25.0%）AZF區(qū)域均完整，但Y染色體存在缺失，其精液常規(guī)檢查顯示無精子、精子少或精子活動力低下；3例（37.5%）AZFa區(qū)域完整，而AZFb和AZFc區(qū)域存在缺失，其臨床表型為性腺萎縮及精液常規(guī)顯示無精子，睪丸組織染色可觀察到精子；1例（12.5%）AZFa區(qū)域缺失，而AZFb和AZFc區(qū)域完整，其臨床表型為睪丸下降且萎縮，性腺功能減退；2例（25.0%）AZF區(qū)域完全缺失，其臨床表型為精液常規(guī)檢查顯示無精子，睪丸穿刺未見各級生精細(xì)胞及精子[5-9]。此外，綜合分析幾篇文獻(xiàn)可以發(fā)現(xiàn)，嵌合Y染色體長臂大片段缺失存活的個體中34.8%（8/23）存在身材矮小的情況，具體原因不明[1，9-13]。

綜上所述，嵌合Y染色體長臂大片段缺失不但影響胎兒性別及生長發(fā)育，還影響胎兒成年后孕育下一代的能力。目前唐氏綜合征篩查及產(chǎn)前超聲檢測均無法對其進(jìn)行排查，有一部分胎兒因此而漏診。本研究對兩例嵌合Y染色體長臂大片段缺失胎兒的產(chǎn)前診斷情況作了詳細(xì)描述，并結(jié)合國內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行了分析，但目前對嵌合Y染色體長臂大片段缺失的發(fā)生機(jī)制尚不明確。