蔬菜-牧草輪作5年草地土壤微生物量變化及其群落結構分異

林棟，張德罡，McCulley Rebecca L.

(1.甘肅農業大學草業學院，甘肅 蘭州 730070；2.美國肯塔基大學植物與土壤科學系，肯塔基州 列克星敦 40546-0091)

作物長期連作會導致土壤質量下降，營養元素失衡，自毒物質和病原微生物積累[1]，尤其在蔬菜類作物連作中更為常見[2]。而蔬菜與牧草輪作能夠有效緩解連作障礙，改善土壤理化性狀和微生態環境，提高農業生態系統的生產力[3]。采用輪作種植模式是全球溫帶地區可持續農業重要的土地利用策略之一[4-5]，該輪作方式在全球范圍內被證實有諸多好處[6]，如增加土壤有機質和生物量，形成潛在的土壤碳匯，減緩氣候變化，對實現農牧業可持續生產具有重要意義，是集生態效益、經濟效益、社會效益于一體的草地農業生產模式，具有廣泛的推廣應用前景[7]。Conant等[8]對全球115項有關耕地或原生植被轉變為草地，以及提高草地管理措施的研究結果進行了統計分析，結果表明耕地轉變為草地顯著增加了土壤碳沉積。Franzluebbers[9]在美國東南部對作物-家畜系統的研究表明，被侵蝕的農田種植多年生牧草后土壤有機質、土壤營養循環、生物和物理狀況顯著提升。中國春秋戰國時期伴隨著土地連作制度的出現，輪作就在古代農耕制度中逐漸形成，雛形是作物和綠肥輪作[10]，目前已廣泛應用于各地區農牧業生產和生態環境保護。李靜等[11]對黃土區不同退耕年限草地土壤理化性質的研究結果表明，隨著退耕年限的增加，草地土壤分離速率逐漸降低，不同退耕年限草地土壤容重、水穩性團聚體含量、根系生物量密度均有不同程度的改變。

土壤微生物直接參與土壤有機質積累和礦化等過程，影響土壤養分循環及其有效性，調節和指示土壤功能[12]，是反映生態系統受到一定干擾后土壤質量變化的指標之一[13-15]。土壤微生物生物量比土壤有機質變化更敏感，其群落結構能很好地區分不同草地生長年限土壤有機質存在的差異。土壤微生物對環境擾動的響應非常迅速，由于能夠較早地預測土壤養分及環境質量的變化過程，被認為是最具潛力的敏感性指標之一[16]。傳統耕作措施下的蔬菜生產，被證實會減少土壤微生物生物量[17-18]和真菌種群數量[19-20]。而放牧草地土壤相比蔬菜農田，能夠維持更高的微生物生物量和新陳代謝潛力[14]。同時，研究表明草地土壤由于較高的微生物群落豐富度和多樣性，而更能抵抗環境脅迫[21]。生態系統忍耐外界干擾的能力，部分依賴于土壤微生物組成[22]。定量分析土壤微生物生物量和群落結構，在探究土壤營養物質循環和積累過程中至關重要，然而在蔬菜-牧草輪作系統中，草地生長年際和季節間的變化規律尚缺乏系統和精確的分析結論。研究蔬菜-牧草輪作過程中牧草生長時間序列上土壤微生物群落結構與功能動態特征，有助于深入理解該輪作措施影響土壤狀況和功能發揮的生物學機制。

1 材料與方法

1.1 研究區概況

研究區位于美國肯塔基州喬治敦縣的埃爾姆伍德有機畜牧場(N 38°13′26″-38°14′00″、W 84°30′08″-84°30′53″)，海拔165～323 m，處于亞熱帶濕潤氣候區的北緣[23]，年均降水量1209 mm，年均氣溫12 ℃，無霜期163～192 d。該有機牧場不使用化肥和除草劑等農藥，一直沿用3年低投入蔬菜生產和5年多年生牧草輪作的生產方式。研究地坡度約2%～6%，土壤類型為淋溶土(國際土壤分類系統)，采樣點土壤類型、坡度、朝向、植被總蓋度等基本立地條件保持一致[24]。

1.2 試驗設計

運用空間代替時間的方法，選取蔬菜-牧草輪作系統中處于不同建植年限的多年生草地作為研究對象，以永久性草地為對照，分析連續5年牧草輪作過程中不同生長年限和不同季節之間草地土壤微生物群落動態特征。研究區輪作草地前茬蔬菜作物種類一致，主要為：甘藍(Brassicaoleracea)、甜菜(Betavulgaris)和胡蘿卜(Daucuscarota)等。多年生草地主要物種為：苜蓿(Medicagosativa)、草地早熟禾(Poapratensis)、高羊茅(Festucaarundinacea)、鴨茅(Dactylisglomerata)、白三葉(Trifoliumrepens)、紅三葉(Trifoliumpratense)和梯牧草(Phleumpratense)。輪作草地生長年限從第1～5年的處理，分別標記為Y1、Y2、Y3、Y4、Y5，近50年未曾耕種過的永久性草地(permanent pasture)標記為P。從每個相同生長年限的草地中隨機選取立地條件基本一致的3個小區(5 m×5 m)作為重復，每個小區內以“S”形布置6個采樣點，于2015年4個季節(春、夏、秋、冬)分別采集0～15 cm土層土壤，6土鉆混合為一袋樣品，塑料自封袋封裝后用冰盒帶回實驗室，過5.66 mm篩，剔除可見植物根莖組織后進行檢測。

1.3 高通量磷脂脂肪酸分析

運用改進后的Buyer等[25]的方法進行高通量磷脂脂肪酸(phospholipid fatty acid, PLFA)分析，檢測研究區草地土壤微生物群落。將新鮮土樣冷凍干燥后取1.0～1.5 g在玻璃試管中溶于4 mL的Bligh-Dyer提取劑(氯仿∶甲醇∶0.05 mol·L-1磷酸鉀緩沖液，體積比1.0∶2.0∶0.8，pH 7.4)，含內標(19∶0, 1, 2-dinonadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)0.5 μL·mL-1，測試組前中后分別加入3個空白對照。通過超聲波降解，加入氯仿和去離子水渦旋振蕩，并離心濃縮進行分離。用1 mL甲醇淋洗50 mg硅膠固相萃取(solid phase extraction，SPE)96孔板(Phenomenex，Torrance，美國)3次，再用1 mL氯仿淋洗3次。加入分離出的樣品后，用1 mL氯仿和1 mL丙酮間隔5 min淋洗，再用0.5 mL甲醇∶氯仿∶水為5∶5∶1的溶劑洗提磷脂。脂肪酸甲酯(fatty acid methyl esters，FAMEs)提取用0.2 mL酯交換反應試劑(0.285 g KOH溶于25 mL甲醇后加8.3 mL甲苯)，在39 ℃下培養15 min進行甲基化。加入0.4 mL 0.075 mol·L-1醋酸、0.4 mL氯仿，反復振蕩分離后在真空離心濃縮系統中干燥30 min提取FAMEs，再用75 μL正己烷溶解。用搭載有自動進樣器、Ultra 2毛細管柱、火焰離子化檢測器和MIDI Sherlock系統(Microbial Identification System Inc.，版本6.2, Newark, DE)的安捷倫7890A氣相色譜儀(Agilent Technologies，Wilmington，美國)測定脂肪酸種類和含量。脂肪酸命名參照Vestal等[26]和Frosteg?rd等[27]的方法，通過MIDI系統微生物特征PLFA譜圖數據庫比對，參考已被廣泛證實的微生物標志脂肪酸，并結合研究區同類土壤微生物區系分析，用特定FAMEs指示不同微生物類群。

1.4 數據統計

草地生長年限、季節及其交互效應對土壤中不同種類FAMEs含量、特定脂肪酸比例和微生物生物量的影響，用JMP統計分析軟件(版本12.0, SAS軟件研究所)進行雙因素方差分析。草地不同生長年限和季節間土壤微生物群落結構的分異(或相似性)，用多元統計分析軟件PC-ORD 6.0(MjM軟件，美國)進行判別，PLFA提取物中相對豐度>1%的FAMEs(n=22)用于非度量多維測度(nonmetric multidimensional scaling，NMS)排序。用S?rensen距離(Bray-Curtis法計算[28])確定樣本間非線性梯度的相關性及方向，并將草地不同生長年限和季節土壤微生物群落結構差異轉化為可視化的NMS排序圖。模型不穩定性判別標準0.00001，步長為0.2，隨機運行250次。同時，分析驅動微生物群落結構分異的主要環境因子。環境變量在NMS排序中顯示為矢量圖，箭頭的長度和角度分別表示相關性強度和方向。多響應置換過程(multi-response permutation procedure，MRPP)是一種非參數多元分析方法，用于判別不同生長年限和季節間土壤各類FAMEs豐度比例的兩兩比較和組間差異顯著性。多重比較的差異顯著性P值進行Bonferroni校正，不同生長年限間15組，季節間6組。

2 結果與分析

2.1 不同年限草地土壤中FAMEs分布特征

從不同生長年限草地和永久性草地土壤中，共檢測出C10到C24的98種FAMEs，其中草地生長第5年土壤中FAMEs種類最多，為92種，比草地建植初期高出19%，永久性草地土壤檢測到85種FAMEs。脂肪酸10:0 3OH和13:1ω4c在草地生長第4和第5年土壤中出現，19:1ω6c、19:0cyclo ω9c、20:2ω6c、24:1ω9c和16:2DMA 5種脂肪酸僅在第5年草地土壤中出現，而14:1ω7c僅在永久性草地土壤中檢測到。不同季節有部分特征脂肪酸出現，例如：10:0(癸酸)、14:1ω9c、19:0cyclo ω9c僅在春季土樣中檢測到，24:1ω9c僅出現在夏季土樣中，16:3ω6c和16:2DMA僅在秋季土樣中檢測到，13:1ω4c和14:1ω7c僅在冬季土樣中出現。夏季、秋季和冬季草地土壤中均檢測到11:0、12:0DMA和19:1ω6c，而在春季土壤中未檢測到。10:0 3OH、20:0iso、20:2ω6c、22:6ω3c和22:4ω6c 5種脂肪酸在春、夏、冬季草地土壤中均有分布，而在秋季土壤中消失。春、夏、秋季草地土壤中均含有10:0 2OH，冬季土壤中卻未檢測到。

隨著草地生長年限的增加，土壤中各類主要脂肪酸比例也隨之發生變化(表1)。草地生長年限對飽和脂肪酸與單一不飽和脂肪酸之比(saturated/monounsaturated，sat/mono)、革蘭氏陽性菌與革蘭氏陰性菌脂肪酸的比例(gram positive/gram negative，G+/G-)產生極顯著影響(P<0.01)，而對環丙烷脂肪酸與其前體脂肪酸之比(cyclopropane/precursors，cy/pre)無顯著影響(P=0.1188)。永久性草地土壤sat/mono低于生長1～5年草地，第2年草地亦低于第1和4年草地。隨草地生長年限的增加，G+/G-有逐漸減小的趨勢，第5年草地G+/G-顯著低于第1和3年，比草地建植初期降低8%，接近永久性草地土壤G+/G-。草地生長5年間異構與反異構脂肪酸之比(isomers/ante-isomers，i/a)無顯著差異(P>0.05)，但除第3年草地外，其他年限草地均顯著高于永久性草地(P<0.01)。真菌脂肪酸與細菌脂肪酸的比例(fungi/bacteria，F/B)，在不同生長年限草地土壤中也表現出顯著差異(P<0.05)，Y5比Y1、Y2、Y3、Y4均高13%，且與永久性草地土壤F/B無顯著差異(P=0.6561)。

季節顯著影響研究區草地土壤中sat/mono、cy/pre、i/a和G+/G-(P<0.01)，sat/mono夏、秋季比春、冬季分別高出20%和27%，cy/pre和i/a夏、秋季亦顯著高于春、冬季，G+/G-在各季節草地土壤中的高低順序為秋季>夏季>冬季≈春季。F/B在不同季節草地土壤中，也表現出顯著差異(P<0.05)，秋季F/B均比春、夏、冬季低13%(表2)。

草地生長年限與季節對sat/mono(P=0.1215)、cy/pre(P=0.2802)、i/a(P=0.9663)、F/B(P=0.0506)和G+/G-(P=0.4700)的交互效應均不顯著。

表1 不同生長年限草地土壤特定脂肪酸比例Table 1 Special FAMEs ratio of pasture soils in different growing years

注：sat/mono，飽和脂肪酸/單一不飽和脂肪酸；cy/pre，環丙烷脂肪酸/前體脂肪酸；i/a，異構脂肪酸/反異構脂肪酸；G+/G-，革蘭氏陽性菌脂肪酸/革蘭氏陰性菌脂肪酸；F/B，真菌脂肪酸/細菌脂肪酸；Y1～Y5，生長1～5年草地；P，永久性草地；不同小寫字母表示在0.05水平上處理間差異顯著，下同。

Note: sat/mono, ratio of saturated to monounsaturated fatty acids; cy/pre, ratio of cyclopropane to precursors fatty acid; i/a, ratio of isomers to ante-isomers fatty acid; G+/G-, ratio of gram positive to negative bacteria; F/B, ratio of fungi to bacteria; Y1-Y5, pastures 1 to 5 years old; P, permanent pasture. Different lowercase letters indicate significant differences between treatments (P=0.05), the same below.

表2 不同季節草地土壤特定脂肪酸比例Table 2 Special FAMEs ratio in pasture soil in different seasons

2.2 不同年限草地土壤微生物量變化

草地生長年限顯著影響土壤細菌、真菌、真核生物、原生動物及其總微生物生物量(P<0.01)，隨著草地生長年限的增加，土壤總微生物量逐年增加，從Y1到Y5增加了46 nmol·g-1土壤，增長了45%，Y5接近永久性草地土壤微生物總量(表3)。細菌和真菌生物量經過草地生長5年分別增長了44%和63%，變化趨勢與土壤總微生物量相似，Y2均高于Y1、Y3和Y4，且與Y5和永久性草地土壤微生物量之間無顯著差異(P>0.05)。真核生物生物量5年增加69%，Y5高于其他年份草地和永久性草地土壤。原生動物生物量在草地生長前4年無顯著差異(P>0.05)，生長5年后增加1倍，且顯著高于生長1～4年草地和永久性草地(P<0.05)。

季節顯著影響草地土壤中真核生物(P=0.0327)和原生動物(P<0.01)生物量的變化(圖1)。春季草地土壤中真核生物生物量為1.8 nmol·g-1，比秋季草地土壤高20%。原生動物生物量在夏季(1.2 nmol·g-1)高于其他3個季節，且存在顯著的草地生長年限×季節的交互效應(P<0.01)，生長第5年草地在夏季的土壤原生動物生物量最高。

表3 不同生長年限草地土壤微生物生物量Table 3 PLFA concentrations of the major microbial groups in pasture soils in different growing years (nmol FAMEs·g-1 soil)

注：表中數據為平均值±標準誤差；Y，草地生長年限；S，季節；Y×S，草地生長年限和季節的交互效應。**表示P<0.01，*表示P<0.05，NS表示不顯著，下同。

Note: Mean±SE; Y, pasture growing year; S, season; Y×S, pasture growing year and season interaction. ** indicates significant difference atP<0.01, * indicates significant difference atP<0.05, NS indicates no significance, the same below.

由表4可知，草地生長5年，土壤細菌中革蘭氏陽性菌(G+)和革蘭氏陰性菌(G-)生物量分別增加了38%和49%。Y5草地土壤G+和G-生物量大于Y1、Y3和Y4，與Y2和永久性草地無顯著差異。Y5草地土壤中的厭氧菌含量高于所有其他年限草地和永久性草地，比草地建植第1年增加67%，但與Y2和永久性草地的差異并不顯著。放線菌在永久性草地土壤中含量最高，生長5年增加38%，Y4與Y5之間無顯著差異。真菌中腐生真菌和叢枝菌根真菌經過草地生長5年，分別增加了75%和41%，并接近永久性草地含量。

圖1 不同季節草地土壤真核生物和原生動物生物量Fig.1 Microbial biomass of eukaryote and protozoa in pasture soil in different seasons 不同小寫字母表示真核生物生物量在季節間存在顯著差異(P<0.05)，不同大寫字母表示原生動物生物量在季節間存在顯著差異(P<0.05)。Different lowercase letters indicate significant difference of eukaryote biomass between seasons while different capital letters indicate significant differences of protozoa biomass between seasons (P<0.05).

研究區草地土壤中的厭氧菌和腐生真菌生物量在不同季節間存在顯著差異(圖2)，但草地生長年限×季節的交互效應均不顯著(表4)。冬季草地土壤厭氧菌平均含量1.8 nmol·g-1，顯著高于秋季(1.5 nmol·g-1)和夏季(1.4 nmol·g-1)，春季亦比夏季高24%。腐生真菌生物量在秋季草地土壤中平均為7.7 nmol·g-1，比春季、夏季和冬季(平均9.7 nmol·g-1)低21%。

2.3 不同年限草地土壤微生物群落結構分異

用相對豐度>1%的22種FAMEs進行非度量多維測度(NMS)排序，其結果揭示了微生物群類在草地不同生長年限和季節間的分異。對不同生長年限草地土壤微生物結構進行NMS排序(圖3)，生長第5年草地和永久性草地土壤微生物結構與生長第1、2、3年草地分離，排序軸1和2累計解釋了82.9%的變異。多響應置換過程(MRPP)分析顯示，Y1、Y2、Y3與Y5、P差異顯著(P<0.05)，而Y1、Y2、Y3、Y4之間無顯著差異(P>0.05)，Y4、Y5、P之間差異亦不顯著(P>0.05)。可見，草地生長4年改變了土壤微生物群落結構，并趨近于永久性草地土壤微生物群落結構。進一步用PC-ORD識別驅動土壤微生物群落結構在草地生長年際間分異的環境因子，環境變量包括土壤有機碳氮、顆粒與非顆粒有機質、碳礦化率、Ca、P、K、Mg、Zn元素含量及其交換量、陽離子交換量等，結果表明土壤碳礦化(carbon mineralization，CM)和顆粒有機質(particulate organic matter，POM)含量是主要驅動因子。

表4 不同生長年限草地土壤細菌和真菌生物量Table 4 PLFA concentrations of bacteria and fungi in pasture soils in different growing years (nmol FAMEs·g-1 soil)

對不同季節草地土壤微生物群落結構NMS排序(圖4)結果表明，秋季草地土壤微生物群落結構與春季、夏季、冬季草地土壤微生物群落結構明顯分離(P<0.01)，排序軸1和2累計解釋82.9%的變異。同時，MRPP分析結果顯示，夏季草地土壤微生物群落結構與冬季草地土壤微生物群落結構差異顯著(P<0.01)，而春季與夏季(P=0.1003)、冬季(P=0.3664)差異均不顯著。

圖2 不同季節草地土壤厭氧菌和腐生真菌生物量Fig. 2 Microbial biomass of anaerobe and saprophytic fungi in pasture soil in different seasons 不同小寫字母表示厭氧菌生物量在季節間存在顯著差異(P<0.01)，不同大寫字母表示腐生真菌生物量在季節間存在顯著差異(P<0.05)。Different lowercase letters indicate significant difference of anaerobe biomass between seasons (P<0.01) while different capital letters indicate significant differences of saprophytic fungi biomass between seasons (P<0.05).

對各季節草地土壤中不同種類FAMEs含量的方差分析表明，秋季草地土壤含有較豐富的G+、G-和放線菌的脂類標志物，例如：15:0iso、15:0anteiso、19:0cycloω7c和16:0 10-methyl等。而在冬季草地土壤中FAMEs類群向叢枝菌根真菌和放線菌生物標記轉變，如16:0 10-methyl和16:1ω5c。腐生真菌(18:1ω9c)和原生動物(20:4ω6c)生物標記在夏季草地土壤中顯著影響微生物群落，而在春季草地土壤中G-標志物(16:1ω7c、18:1ω7c等)含量顯著增加。

3 討論

3.1 草地生長年限和季節對土壤中FAMEs的影響

從檢測到的FAMEs種類可以看出，輪作系統中隨著牧草生長年限的增加，FAMEs種類不斷增加，表明土壤微生物多樣性隨牧草種植年限的延長有提高的趨勢，但永久性草地土壤FAMEs種類數低于生長5年的草地。白麗等[29]對黃土高原草地次生演替的研究表明，前30年土壤微生物多樣性逐漸增大，之后緩慢下降。長期單一的土地利用方式相比草地輪作降低了土壤微生物多樣性，此結果與張笑宇等[30]對煙草(Nicotianatabacum)輪作的研究結果一致，同時符合中度干擾假說[31]的生態學規律。

不同土地利用方式的土壤具有特定的脂肪酸類群和微生物群落結構[32]，Acosta-Martínez等[14]報道了放牧草地與蔬菜農田相比，真菌PLFA標志物增加(例如18:2ω6c、18:1ω9c、16:1ω5c)，造成了土壤微生物群落結構的差異。蔬菜輪作為牧草4年后，土壤中陸續出現一些新的脂肪酸種類，例如表征革蘭氏陰性菌的10:0 3OH、13:1ω4c、19:1ω6c、19:0cyclo ω9c、24:1ω9c，表征厭氧菌的16:2DMA和表征真核生物的20:2ω6c，可以指示草地生長年限增加過程中土壤微生物的發生學關系，說明部分脂肪酸種類更適宜于較長生長年限的草地土壤微環境。研究表明[33]，20:4ω6c與土壤酶活性和土壤微生物量密切相關。永久性草地土壤飽和脂肪酸與單一不飽和脂肪酸之比顯著降低，可能是土壤有機質含量較高的結果。Bossio等[34]的研究表明，在養分充足的土壤環境中，不飽和脂肪酸的比例會更高。

圖3 不同生長年限草地土壤微生物群落結構非度量多維測度排序Fig. 3 PC-ORD nonmetric multidimensional scaling (NMS) ordination biplots using relative abundance of FAMEs>1% in pasture soil in different growing years Y1～Y5：生長1～5年草地 Pastures 1 to 5 years old；P：永久性草地 Permanent pasture；POM：土壤顆粒有機質 Particulate organic matter；CM：土壤碳礦化 Carbon mineralization.

圖4 不同季節草地土壤微生物群落結構非度量多維測度排序Fig. 4 NMS ordination biplots using relative abundance of FAMEs>1% in pasture soil in different seasons Sp：春季 Spring；Su：夏季 Summer；F：秋季 Fall；W：冬季 Winter.

不同季節草地土壤中出現了特異脂肪酸，或有部分脂肪酸在特定季節消失，可能是土壤微生物對季節間水熱配比狀況差異的響應。不同生長年限草地土壤在夏秋季飽和脂肪酸與單一不飽和脂肪酸之比顯著高于春冬季，Moore-Kucera等[35]的研究結果也表明，夏季干旱脅迫引起飽和與不飽和脂肪酸比例升高。特定脂肪酸比例變化可以表征土壤微生物對環境脅迫的應答，但前提條件是環境壓力導致了細菌細胞膜結構組成的改變[36]。

3.2 草地生長年限和季節對土壤微生物量的影響

蔬菜-牧草輪作系統中，隨著草地生長年限的增加，土壤微生物量顯著增加，并接近永久性草地土壤微生物含量。Acosta-Martínez等[33]在德州西部的研究表明，多年生牧草和黑麥(Secalecereale)-棉花(Gossypiumhirsutum)輪作土壤微生物量高于棉花連作。徐麗君等[37]對不同生長年限紫花苜蓿人工草地的研究結果表明，1～4年土壤微生物量逐漸增加，第5年開始減少。不同生長年限草地土壤的微生物總量、細菌、真菌和放線菌生物量在季節間無顯著差異，暗示季節并不影響土壤中占比較大的微生物類群的生物量，大部分微生物量在季節間保持基本穩定。然而，占比較小的真核生物、原生動物、腐生真菌、厭氧菌生物量在不同季節間有顯著差異。李振高等[38]和Bell等[39]指出，土壤溫度和水分的季節變化直接控制著生態系統中微生物量和酶活性波動，土壤微生物量碳與土壤濕度、溫度、降水和平均氣溫等非生物因素具有顯著正相關關系。同時，土壤微生物量季節性漲落還與土壤中可利用碳和養分資源的限制、植物生長節律有關[40]。

3.3 草地生長年限和季節對土壤微生物群落結構和功能的影響

牧草種植5年土壤真菌與細菌比率顯著提高，指示土壤功能發生重要變化[21]。研究表明，土壤微生物真菌途徑對碳的存儲能力較強[41]，部分ε-變形菌屬的細菌通過分泌特異性酶影響CO2固定能力[42]。真菌菌絲被認為是土壤中不穩定性碳和營養物質的重要來源，在細菌接近顆粒碳底物的過程中發揮著關鍵作用[43]。草地生長5年，叢枝菌根真菌含量增加，且在永久性草地土壤中最多。Bainard等[44]在加拿大草原的研究表明，對于長期放牧草地，叢枝菌根真菌能增強土壤氮和磷的吸收與轉化，提高牧草耐受干旱脅迫的能力，促進土壤團聚體的形成和穩定性。隨著草地生長年限的延長，革蘭氏陽性菌占比逐漸減小，而革蘭氏陰性菌比例增大。Romaniuk等[45]也證實革蘭氏陰性細菌在生長10年的放牧草地土壤中較多，革蘭氏陰性菌含量常隨著土壤有機碳有效性的增強而增加[46]。Riah-Anglet等[21]對土壤微生物群落結構與功能的關系研究表明，永久性草地土壤微生物群落結構的改變與功能的變化緊密關聯。草地生長第2年土壤微生物生物量顯著增加，但群落結構在草地生長4年才發生顯著變化，說明量變積累到一定階段后才會發生結構性的質變。Xue等[47]對不同土地利用系統的研究也發現，微生物生物量的變化不一定總是伴隨著微生物群落多樣性和活性的變化。

季節變化影響草地土壤微生物群落[48]，不同生長年限草地土壤微生物群落結構在秋季顯著區別于其他季節，夏季與冬季不同。Slaughter等[49]在本試驗區附近的草地研究結果也表明，季節顯著影響草地土壤微生物群落結構。Stevenson等[48]對新西蘭北島溫帶氣候區草地的研究也表明，秋季土壤細菌群落明顯區別于其他季節，本研究結果與此一致。季節間土壤微生物群落結構的變化與非生物因素有關，例如土壤溫度、濕度及其綜合作用等。土壤微生物群落結構變化導致其分解功能穩定性發生改變[50]，本研究中草地土壤微生物群落結構秋季不同于其他季節，秋季土壤碳礦化潛力也顯著低于其他季節。

4 結論

隨著蔬菜-牧草輪作系統中草地生長年限的增加，土壤微生物的脂肪酸種類和數量逐漸增加。草地生長4年后土壤中出現新的脂肪酸種類，不同季節亦有特征脂肪酸出現或消失。草地生長5年土壤微生物總生物量增加45%，接近永久性草地土壤微生物生物量。其中原生動物生物量增加1倍，腐生真菌增加75%。季節顯著影響真核生物、原生動物、腐生真菌、厭氧菌生物量和特定脂肪酸比例。草地生長4年后土壤微生物群落結構發生顯著改變，且趨近于永久性草地土壤微生物群落結構。土壤碳礦化和顆粒有機質含量的變化是驅動土壤微生物群落結構分異的主要環境因子。