二氧化鈦納米顆粒的肝細胞毒性及分子機制研究

洪鴻翔，陳勁宇，鄧宏健，孫郁雨，袁 錕，王祥宇，崔志明

目前，老齡化已成為世界范圍公認的社會問題，衰老導致人體骨量下降、骨質疏松、關節炎癥、關節退變，并由此引起重要關節部位疾病、甚至功能的喪失。骨骼問題引起的疾病是最普遍存在的人類健康問題，而生物醫用金屬材料成為解決這些問題的重要方法之一。二氧化鈦（TiO2）是一種具有耐化學腐蝕性、光化學催化特性的無機化工材料，被廣泛用于醫藥、日化、化妝品、食品中。研究表明[1]TiO2能夠通過呼吸、消化等途徑進入體內，并且在特定部位富集，從而對機體產生毒性。文獻報道[2]，TiO2在肝中沉淀最多，隨著TiO2濃度的升高，肝功能受到明顯損害，并導致抗氧化系統、免疫系統衰竭、全身出現炎癥反應等一系列綜合征。PD-1/PD-L1信號通路是動物體中較為保守的信號通路，對機體免疫調控起著重要的作用[3]。本研究從PD-1/PD-L1信號通路入手，探討TiO2對小鼠肝細胞的毒性作用，從而為了解TiO2毒性及其防治提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及主要試劑與設備 清潔級ICR小鼠由南通大學實驗動物中心提供，合格證號：SYXK(蘇)20020022；TiO2購自上海醫藥集團；兔抗小鼠 PD-1、 兔抗小鼠 PD-L1、Rat anti-mouse-CD19-FITC、Rat anti-mouse-CD4-FITC、Rat anti-mouse-CD8-PE、兔抗GAPDH及山羊抗兔IgG購自美國abcam公司；IL-6、IL-10、TNF-α、CRP 試劑盒購自上海西唐生物科技有限公司；生化自動分析儀（日本日立，型號：7170），高速冷凍離心機（德國eppendorf,型號：5180），電泳槽（北京六一儀器廠，型號：DYY-Ⅲ），凝膠成像系統（美國 Bio-Rad，型號：GEL DOC2000）。

1.2 模型構建和分組處理 實驗前小鼠適應性飼喂5 d，然后隨機分為4組，每組30只，分別為空白組、TiO2（低、中、高劑量）組，TiO2組每天分別尾部靜脈注射10、50、150 mg/kg的TiO2， 空白組注射10 ml/kg生理鹽水，連續注射2 w。

1.3 檢測指標

1.3.1 體重及肝臟系數 注射給藥2 w后，稱量實驗小鼠體重后，麻醉、處死，取肝臟，吸水紙吸干水分，準確稱量肝臟重量，肝臟系數=肝臟濕重（mg）/體重（g）。

1.3.2 肝功能 上述小鼠處死后，采用摘眼球取血法采集血液，25000 r/min離心10 min分離血清，采用全自動生化分析儀檢測谷丙轉氨酶（ALT）、天冬氨酸轉氨酶（AST）、亮氨酸氨酸肽酶（ALP）、乳酸脫氫酶（LDH）水平。

1.3.3 血清炎癥因子含量 采用上述血清標本，檢測白細胞介素 -6（IL-6）、IL-10、腫瘤壞死因子（TNF-α）、C-反應蛋白（CRP）水平。

1.3.4 肝組織抗氧化酶活性 小鼠處死后，取新鮮肝組織研磨，加入1%聚乙稀吡咯烷酮，5000 r/min離心30 min，取上清液，測定超氧化物歧化酶(SOD)，過氧化氫酶(CAT)，抗壞血酸過氧化物酶(APx)，谷胱甘肽過氧化物酶(GSHPx)活性。

1.3.5 檢測PD-1、PD-L1蛋白表達水平 稱取200 mg肝組織，加入裂解液，超聲裂解30 s，12000 r/min、4℃離心10 min，收集上清，BCA檢測蛋白濃度；待測樣品與Loading buffer混合，加入至制備好的SDS-PAGE 凝膠上樣孔中，25 μl/孔，4 ℃轉膜 1.5 h，采用5%脫脂奶粉封閉PVDF膜2 h，分別加入一抗兔抗小鼠PD-1或兔抗小鼠PD-L1，4℃過夜；TBST洗膜后，加入辣根過氧化物標記的羊抗兔IgG，37℃孕育2 h，ECL顯影，以GAPDH作為內參，采用蛋白免疫印跡法檢測PD-1和PD-L1蛋白水平。

1.4 統計學方法 應用SPSS 16.0統計軟件分析，計量數據以±s表示，組間比較采用方差分析和t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 TiO2對小鼠肝臟系數的影響 空白組、低劑量TiO2組、中劑量TiO2組和高劑量TiO2組的肝臟系數分別為（39.87±4.32）、（51.12±4.78）、（63.81±5.04）和（72.95±5.29）mg/kg，各 TiO2組肝系數均顯著高于空白組（P＜0.05），且隨著劑量增加，肝臟系數逐漸增大（P＜ 0.05）。

2.2 TiO2對小鼠肝功能的影響 各TiO2組血清ALT、AST、ALP、LDH 水平均明顯高于空白組（P＜0.05）， 且劑量越大，ALT、AST、ALP、LDH 水平越高（P＜ 0.05，表 1）。

2.3 TiO2對肝組織抗氧化酶活性的影響 各TiO2組肝組織抗氧化酶活性均明顯低于空白組（P＜0.05），且劑量越大，肝組織抗氧化酶活性越低（P＜0.05，表 2）。

2.4 TiO2對小鼠血清炎癥因子含量的影響 各TiO2組血清炎癥因子含量均明顯高于空白組（P＜0.05），且劑量越大，炎癥因子含量越高（P＜0.05，表3）。

2.5 TiO2對小鼠肝組織PD-1、PD-L1蛋白表達的影響 與空白組比較，各TiO2組肝組織PD-1、PD-L1蛋白表達水平明顯升高，且呈劑量效應依賴關系（P＜0.05，圖 1）。

3 討論

隨著TiO2的廣泛應用，其安全性越來越受重視。TiO2可以通過口腔、鼻腔、皮膚等途徑進入機體，通過血液循環、淋巴轉運在機體的各器官中沉積，如肝腎等，并對器官產生毒性作用。研究表明[4]，靜脈注射TiO21 w后，肝臟明顯腫大，肝組織細胞損傷變性，AST和ALT活性上升。本研究采用TiO2構建小鼠肝損傷模型，結果也顯示，TiO2能夠明顯提高肝臟系數，ALT、AST、ALP、LDH 活性明顯升高，且劑量越大，ALT、AST、ALP、LDH 水平越高。

表1 各實驗小鼠肝功能比較（n=30）

正常情況下，機體內ROS產生和清除處于動態平衡，而TiO2會打破平衡，造成ROS大量積累，進而導致過氧化損傷[5]。研究表明[6]，TiO2在肝細胞中的積累導致ROS和Cyp1a1的表達水平增加，并抑制CAT等多種過氧化物酶的活性，進而導致肝臟的氧化損傷。本研究結果發現，各TiO2組肝組織抗氧化酶活性均明顯低于空白組（P＜0.05），且劑量越大，肝組織抗氧化酶活性越低，提示TiO2能夠使肝臟抗氧化系統遭受破壞，其毒性效果與劑量呈正相關。

表2 各組肝組織抗氧化酶活性比較（n=30）

表3 各組血清炎癥因子含量比較（n=30）

圖1 各組PD-1、PD-L1肝組織PD-1、PD-L1蛋白表達水平比較

文獻報道[7]，肝內炎癥反應會導致肝功能障礙，同時還會加重肝臟重構。既往研究結果顯示[8-9]，TiO2能顯著激活 MIF、TNF-a、IL-6、IL-1β、CRP、IL-4 和 IL-10等細胞炎癥因子 mRNA和蛋白表達水平。本研究結果也顯示，TiO2會引起 TNF-α、IL-6、IL-10、CRP水平升高，且劑量越大，炎癥因子含量越高，證實TiO2會引起小鼠機體炎癥反應。

文獻報道[10]，PD-1/PD-L1信號通路在T細胞活化、增殖、免疫細胞和炎癥因子產生的過程中起重要的作用，該信號通路激活會抑制免疫系統功能，促進免疫耐受。經典的PD-1/PD-L1信號通路活化表現為PD-1在細胞質中增多，進而調節Th1細胞Th2的反應。本研究結果顯示，與空白組比較，各TiO2組肝組織PD-1、PD-L1蛋白表達水平明顯升高，且呈劑量效應依賴關系，提示TiO2對肝細胞的毒性作用可能是通過調節PD-1/PD-L1信號通路實現。

綜上所述，TiO2可能通過PD-1/PD-L通路對小鼠肝細胞產生毒性作用，且其毒性具有劑量效應關系。