肝癌患者腫瘤組織和血清lncRNAs水平變化的研究

王一涵，馮亞星，劉衛輝

肝細胞肝癌(HCC)是癌癥死亡的第三大緣由之一的惡性腫瘤[1]。由于HCC具有侵襲性強、轉移率高和隱蔽性強等特點，大多數HCC患者確診時已為中晚期[2]。目前，影像學檢查和腫瘤標志物檢測為HCC的早期診斷與篩查的兩大類檢測手段。傳統的影像學檢查依賴于操作者的技術和經驗，使HCC的早期診斷存在有一定的誤差[3]。此外，近年來研究發現，腫瘤標志物甲胎蛋白(AFP)在HCC患者中存在一定的假陰性，特異性不盡如人意。因此，尋找高效的HCC早期預測診斷標志物，將有利于提高HCC患者的生存率[4]。

近年來研究發現，長鏈非編碼RNA(lncRNA)能夠發揮許多重要的生物學功能，可通過外源性沉默、剪切調控、作為ceRNA與對應miRNA相作用、與蛋白質相互作用以及遺傳變異等多種方式調控基因表達[5]。許多lncRNAs通過影響腫瘤細胞的生長、凋亡、浸潤與轉移等生理過程成為新的腫瘤標志物的重要來源[6]。本研究結合已有研究及文獻報道，挑選了4個與腫瘤發生密切相關的lncRNAs，包括lncRNA HOTAIR[7]、lncRNA HOTTIP[8]、lncRNA DANCR[9]和lncRNA TCF7[10]，這些lncRNAs密切調控上皮-間質轉化(EMT)過程及腫瘤干細胞特性維持。本研究通過檢測上述lncRNAs在HCC組和對照組組織和血清中的表達情況，討論其作為HCC早期診斷標志物的潛在價值，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 病例資料 選取醫院2017年9月～2018年9月收治的28例HCC患者（HCC組），以及同期12例肝血管瘤患者（對照組），均經組織病理學檢查確診。本研究經醫院倫理委員會批準，所有患者及其家屬均知情同意。

1.2 標本取材及處理 所有受試者均用干燥采血管抽取其外周靜脈血各4 ml，于4℃靜置≥0.5 h。離心機在4℃400 r/min條件下離心10 min；取上清，之后4℃ 1800 r/min再離心10 min，最后得血清待測。另收集患者手術切除的肝血管瘤組織和HCC患者的癌組織和癌旁組織（距癌組織邊緣超過2 cm，病理檢查未見癌細胞）標本。

1.3 檢測指標 取上述血清和組織標本，分別使用TRI REAGENT BD和TRIZOL（美國加州Invitrogen life technologies）試劑提取總RNA[11]。將所得的RNA根據反轉試劑盒使用操作說明書將其反轉錄成cDNA。用Real-time PCR檢測組織和血清中lncRNAs的相對表達量， 采用 2×PCR master mix（Arraystar），取適量cDNA作為摸板，10 μl體系進行擴增，以β-actin為內參基因。

1.4 統計學方法 應用SPSS 18.0統計軟件分析，計量資料以±s表示，多組間比較采用One-way ANOVA分析，兩組間比較采用t檢驗；評估HCC的診斷價值時，通過受試者工作特征曲線下面積(AUC)進行評估；P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 組織中各lncRNAs的表達水平比較 HCC癌組織中，lncRNA DANCR和lncRNA TCF7相對表達量明顯高于肝血管瘤組織和癌旁組織 (P＜0.05)，而 lncRNA HOTAIR 和 lncRNA HOTTIP相對表達量與肝血管瘤組織與癌旁組織相對表達量則無明顯差異(P＞0.05)。見表1

表1 兩組組織中各lncRNAs表達水平比較

2.2 血清中各lncRNAs表達水平比較 與對照組比，HCC組血清中 lncRNA DANCR和 lncRNA HOTTIP表達量顯著上調(P＜0.05)，lncRNA HOTAIR和lncRNA TCF7的表達量則無顯著差異(P＞0.05，表2)。

表2 兩組血清中各IncRNAs表達水平比較

2.3 血清lncRNAs表達水平對HCC的診斷效能血清lncRNA HOTAIR診斷HCC的AUC為0.563(95%CI：0.387～0.738,P＞ 0.05)，lncRNA DANCR 為0.821(95%CI：0.677～0.966,P＜ 0.05)，lncRNA HOTTIP為0.902(95%CI：0.806～0.998,P＜ 0.01)，lncRNA TCF7為0.563(95%CI：0.347～0.778,P＞ 0.05)。 聯合 lncRNA DANCR和lncRNA HOTTIP檢測診斷的AUC為0.929(95%CI：0.808～0.996,P＜ 0.01)，見圖 1、2。

3 討論

HCC作為一種世界范圍內高發的癌癥，大多數HCC患者在確診時已是中晚期。目前亟待解決的問題就是尋找穩定可靠的腫瘤標志物，改善HCC缺乏有效早期診斷手段的難題。

近年研究發現，lncRNA是調節多種生物過程的重要參與者，lncRNA的異常表達與腫瘤的發生密切相關[12]。據報道，lncRNA可作為競爭性內源RNA（ceRNA）進行調控，以便在轉錄后與其他RNA轉錄物進行通信[13]。Chang等研究發現，lncRNA XIST被加工成microRNA片段（miRNA-181a），它可以通過靶向PTEN促進 HCC轉移[14]。lncRNA HULC、lncRNA PVT1、lncRNA ATB、lncRNA DANCR、lncRNA HEIH等先后被報道在原發性肝癌組織中差異表達，與肝癌發生、發展密切相關。因此，lncRNA被認為是HCC患者預后和預測的生物標志物。

本研究主要立足于腫瘤干細胞及EMT過程，這兩個與HCC發生密切相關的生物學事件，選擇與二者密切相關的 4個 lncRNAs（lncRNA HOTAIR、lncRNA HOTTIP、lncRNA DANCR和lncRNA TCF7）進行研究。Zhang等[15]研究發現，lncRNA HOTAIR通過Wnt信號通路調節EMT過程，通過維持干細胞特性參與肝癌的發生與發展過程。與此同時，lncRNA HOTTIP因為與lncRNA HOTAIR來源的位置相近，同時也與EMT過程及腫瘤干細胞特性維持密切相關[16]。Liu等[17]研究指出，lncRNA DANCR在干細胞樣肝癌細胞中過表達，可以通過調節EMT過程進而與肝癌發生密切相關。Yan等[18]研究發現，lncRNA TCF7在HCC細胞和肝癌干細胞中高表達，并且lncRNA TCF7能誘導EMT過程的發生。

本研究結果顯示，在HCC患者癌組織中，lncRNA DANCR和lncRNA TCF7水平表達顯著上調，而lncRNA HOTAIR和lncRNA HOTTIP水平表達則無顯著差異。而在HCC患者血清中，lncRNA HOTTIP和lncRNA DANCR的相對表達量均顯著上調。最后為了評估所選lncRNAs對HCC的診斷效能，本研究根據血清4個lncRNAs表達水平繪制ROC曲線，結果顯示，血清lncRNA HOTTIP和lncRNA DANCR聯合檢測的診斷效能最佳，其AUC為0.929。

圖2 lncRNA DANCR與lncRNA HOTTIP聯合檢測診斷HCC的ROC曲線

圖1 血清lncRNAs分別單獨檢測診斷HCC的ROC曲線

綜上所述，lncRNA HOTTIP和lncRNA DANCR無論是單獨或二者聯用，均有望成為HCC早期預測診斷指標，而二者聯合的診斷效能最佳。本研究也存在一定的局限性，如樣本量較少。其次，本研究為單中心研究，且未對所選標志物用于患者預后的長期隨訪。