負(fù)載利福平骨水泥的制備及體外釋放實(shí)驗(yàn)研究

余涌杰 賴 震 費(fèi) 駿 胡勝平

骨關(guān)節(jié)結(jié)核是危害嚴(yán)重的疾病，藥物難以達(dá)到病灶，導(dǎo)致骨結(jié)核遷延不愈。骨關(guān)節(jié)結(jié)核常采用病灶清除后局部輔以抗結(jié)核藥物，然而抗結(jié)核藥物在局部迅速擴(kuò)散，難以長時(shí)間維持有效濃度。本實(shí)驗(yàn)通過現(xiàn)代骨水泥技術(shù)，構(gòu)建負(fù)載不同劑量利福平的骨水泥，并研究負(fù)載利福平骨水泥的藥物釋放濃度行為，為優(yōu)化抗結(jié)核骨水泥提供理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 藥 品 利福平膠囊，浙江醫(yī)藥股份有限公司新昌制藥廠，批號(hào)180406。

1.2 試 劑 氫氧化鈉（NaOH），規(guī)格：AR500g，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)1 310732；磷酸二氫鈉（NaH2PO4），規(guī)格：AR500g，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)13 472350；磷酸鈉（Na2HPO4），規(guī)格：AR500g，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)20 040618；氯仿，規(guī)格：AR500mL，廣州化學(xué)試劑廠，批號(hào)20 150910；鹽酸（HCl），規(guī)格：AR500mL，廣州化學(xué)試劑廠，批號(hào)20 150716；溴甲酚綠，規(guī)格：AR500g，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)76-60-8。

2 方 法

2.1 實(shí)驗(yàn)分組 根據(jù)負(fù)載利福平劑量不同將載藥骨水泥分為三組，實(shí)驗(yàn)1 組：負(fù)載0.75g 利福平骨水泥，實(shí)驗(yàn)2 組：負(fù)載1.5g 利福平骨水泥，實(shí)驗(yàn)3 組：負(fù)載2.25g 利福平骨水泥，對(duì)照組為國際標(biāo)準(zhǔn)化（International Organization for Standardization，ISO）組。

2.2 負(fù)載利福平骨水泥樣品制備 將利福平膠囊按0.75、1.5、2.25g 劑量分別與40g 骨水泥在無菌條件下真空攪拌，并加入骨水泥單體15mL，繼續(xù)攪拌2min 后，加入由聚乙烯制成的模具之中塑形，制成直徑6mm、厚度3mm 的矮圓柱體實(shí)驗(yàn)樣品，每組制備6 個(gè)。

2.3 負(fù)載不同劑量利福平抗結(jié)核骨水泥物理特性測(cè)定（1）面團(tuán)時(shí)間測(cè)定從骨水泥粉劑與液相混合開始，每隔15s 用帶外科手套的手指輕輕探觸暴露的骨水泥表面，直至手指能干凈地與骨水泥表明分離，而不粘有纖絲的時(shí)間為面團(tuán)時(shí)間；（2）凝固時(shí)間測(cè)定從混合開始至水泥達(dá)到最高溫度，兩者中所需時(shí)間為凝固時(shí)間[1-2]。

2.4 體外藥物釋放實(shí)驗(yàn)（1）將負(fù)載不同劑量的利福平骨水泥和空白樣骨水泥浸泡于50mL 生理鹽水中；（2）震蕩加熱，溫度設(shè)為：37℃；（3）3 天取樣1 次，并且將樣品再次浸泡于50mL 新鮮生理鹽水中，繼續(xù)釋放，共釋放15 天；（4）用紫外可見光分光光度計(jì)，對(duì)釋放液在474nm 處檢測(cè)吸光值，并記錄好數(shù)據(jù)；（5）藥品濃度與吸光值A(chǔ) 之間的線性回歸方程為：A=0.0741C+0.0005，r=0.9996，在1.0～25.0μg/mL 范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。

3 結(jié)果

3.1 負(fù)載不同劑量利福平骨水泥的面團(tuán)時(shí)間和凝固時(shí)間比較 負(fù)載不同劑量利福平后，骨水泥的面團(tuán)時(shí)間和凝固時(shí)間均大于對(duì)照組（國際標(biāo)準(zhǔn)化3～15s），利福平劑量越大，面團(tuán)時(shí)間和凝固時(shí)間越長，三組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 各組骨水泥物理特性測(cè)試比較（min，±s）

表1 各組骨水泥物理特性測(cè)試比較（min，±s）

注：與實(shí)驗(yàn)1 組比較，*P＜0.05；與實(shí)驗(yàn)2 組比較，△P＜0.05；實(shí)驗(yàn)1 組為負(fù)載0.75g 利福平骨水泥；實(shí)驗(yàn)2 組為負(fù)載1.5g 利福平骨水泥；實(shí)驗(yàn)3 組為負(fù)載2.25g 利福平骨水泥

3.2 不同時(shí)間點(diǎn)負(fù)載不同劑量利福平骨水泥體外藥物釋放結(jié)果比較 在生理鹽水中浸泡后，骨水泥基體中的利福平會(huì)逐漸釋放，在前3 天藥物釋放速率比較平緩，三組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。3 天后利福平釋放開始逐漸加快，在第6 天時(shí)三組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），達(dá)到釋放高峰，此后釋放減慢，到第9 天時(shí)三組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），藥物的釋放狀態(tài)達(dá)到平穩(wěn)緩釋效果，在第12天時(shí)三組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。這種平穩(wěn)狀態(tài)并持續(xù)釋放到實(shí)驗(yàn)結(jié)束，第15 天時(shí)三組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

4 討論

骨關(guān)節(jié)結(jié)核治療過程中，抗結(jié)核藥物很難在病灶局部達(dá)到有效濃度，這是骨關(guān)節(jié)結(jié)核難以治愈的主要原因[3]。研究顯示，在骨關(guān)節(jié)結(jié)核病灶中，病灶周圍的硬化骨會(huì)阻礙抗結(jié)核藥物向病灶滲透，血液和病灶外圍健康組織中的結(jié)核藥物不能充分?jǐn)U散到患者的結(jié)核病灶中的膿腫和干酪組織壞死中，因此在病灶部位填充一定的生物材料，填充材料可在局部長期緩慢釋放抗結(jié)核藥物，可以提高療效[4]。載利福平骨水泥復(fù)合體，具有良好的生物相容性，負(fù)載利福平骨水泥可有效避免局部使用抗結(jié)核藥物的突釋，在局部維持一定抗結(jié)核藥物緩慢，有望改善現(xiàn)有治療骨結(jié)核過程中出現(xiàn)骨缺損生物替代材料和局部用藥的不足，是一種行之有效的治療途徑[5]。

采用現(xiàn)代骨水泥技術(shù)將利福平與骨水泥在真空無菌條件下混合，可最大限度降低負(fù)載抗結(jié)核藥物對(duì)骨水泥理化性質(zhì)的影響。測(cè)定負(fù)載不同劑量利福平骨水泥的面團(tuán)時(shí)間和凝固時(shí)間結(jié)果，可以評(píng)估載藥骨水泥的理化性質(zhì)變化，是判斷載藥骨水泥能否在臨床中應(yīng)用的重要依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)負(fù)載不同劑量的利福平后，骨水泥的面團(tuán)時(shí)間和凝固時(shí)間均大于對(duì)照組，利福平劑量越大，面團(tuán)時(shí)間和凝固時(shí)間越長。骨水泥負(fù)載藥物后，藥物會(huì)在骨水泥固-液表面產(chǎn)生一定的正吸附，隨著界面上負(fù)載的藥物濃度增加，骨水泥表面自由能就降低，使骨水泥的面團(tuán)時(shí)間和凝固時(shí)間延長，雖然負(fù)載不同劑量的利福平后，骨水泥的面團(tuán)時(shí)間和凝固時(shí)間均大于對(duì)照組，但利福平的存在并不影響骨水泥載體的最終產(chǎn)物性能，符合臨床應(yīng)用的需要[6]。

本研究結(jié)果顯示，負(fù)載利福平骨水泥在前3 天藥物釋放初期釋放速率比較平緩，第3 天后利福平釋放開始逐漸加快存在突釋效應(yīng)，在第6 天時(shí)達(dá)到了釋放的高峰，三組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），因?yàn)槌跗诘乃幬镝尫胖饕枪撬啾砻胬Ｆ降目焖籴尫牛S著藥物的不斷釋放，載體表面的利福平釋放逐漸減少，骨水泥內(nèi)部的藥物釋放占據(jù)主導(dǎo)[7]。到第9 天時(shí)藥物的釋放狀態(tài)達(dá)到平穩(wěn)緩釋效果，在第12 天和第15 天時(shí)檢測(cè)各組釋放情況，三組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。利福平藥物含量的骨水泥樣品中藥物釋放情況與時(shí)間相關(guān)，其與Ginelma 等[8]研究一致，負(fù)載利福平骨水泥中的藥物是通過骨水泥載體中的微孔來擴(kuò)散釋放，所以其利福平的釋放率與藥物在基質(zhì)骨水泥中的分布有關(guān)，藥物從微孔內(nèi)通過擴(kuò)散機(jī)制釋放，藥物釋放速率與利福平藥物在骨水泥內(nèi)的擴(kuò)散度有關(guān)，而與厚度無關(guān)。負(fù)載利福平骨水泥則能有效維持局部藥物濃度，有效控制了常見的藥物突釋效應(yīng)，從而在骨關(guān)節(jié)結(jié)核病灶治療中起到維持治療劑量的局部藥物濃度，有利于病灶局部結(jié)核的控制，具有良好的應(yīng)用前景。

目前本研究僅限于體外實(shí)驗(yàn)，藥物的體外釋放特性不能代表其臨床治療特性，其療效仍需進(jìn)一步研究確定。

表2 不同時(shí)間點(diǎn)各組負(fù)載利福平骨水泥藥物釋放測(cè)試結(jié)果比較（μg/mL，±s）

表2 不同時(shí)間點(diǎn)各組負(fù)載利福平骨水泥藥物釋放測(cè)試結(jié)果比較（μg/mL，±s）

注：與實(shí)驗(yàn)1 組比較，*P＜0.05；與實(shí)驗(yàn)2 組比較，△P＜0.05；實(shí)驗(yàn)1 組為負(fù)載0.75g 利福平骨水泥；實(shí)驗(yàn)2 組為負(fù)載1.5g 利福平骨水泥；實(shí)驗(yàn)3 組為負(fù)載2.25g 利福平骨水泥