H2S通過調控iNOS/HO-1/Bax/Caspase3軸對尿源性膿毒血癥所致急性腎損傷的保護作用研究①

唐亞純 許武軍 陳 仙 王斌輝 郭 濤 吳孝斌 符 浩

(南華大學附屬南華醫院泌尿外科，衡陽421002)

尿源性膿毒血癥是由泌尿生殖系統感染引起的一種全身性惡性炎癥反應綜合征[1]。近年來，隨著醫療水平的不斷提高，抗感染治療以及器官功能支持療法獲得快速發展，但尿源性膿毒血癥患者死亡率依然較高[2]。腎臟是尿源性膿毒血癥患者最易受損的臟器之一，急性腎損傷(Acute kidney injury，AKI)是膿毒血癥常見的一種重癥并發癥，由膿毒血癥誘導的AKI死亡率可高達75%左右[3]。硫化氫(H2S)作為繼NO和CO之后公認的第3種氣體信號分子，其被證明參與機體多種生理病理過程。例如，外源性H2S能夠通過調節炎癥反應改善內毒性急性肺損傷[4]。通過抗心肌細胞凋亡，H2S對糖尿病大鼠心肌損傷具有保護作用[5]。其還通過調控miR-21表達抑制內質網應激介導肺成纖維化細胞凋亡[6]。而目前，H2S對尿源性膿毒血癥誘發AKI的保護作用研究還尚未見報道。本研究通過建立兔上尿路大腸桿菌感染所致的膿毒血癥模型，探究iNOS/HO-1/Bax/Caspase3軸在H2S保護尿源性膿毒性AKI中的作用。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物及菌種 40只雄性新西蘭大耳白兔，體重(2.0±0.2)kg，購自南華大學實驗動物學部。實驗開始前，實驗動物先在動物室適應性喂養1周，自由進食，環境濕度45%～60%，溫度(23±2)℃。大腸桿菌(ATCC25922)由南華大學附屬南華醫院微生物室提供。

1.1.2主要藥品及試劑 H2S供體NaHS和H2S合成酶抑制劑PAG購自Sigma公司；IL-1β、IL-6和TNF-α酶聯免疫吸附測定試劑盒購自武漢Bio-swamp公司；DAPI染液、活性氧ROS檢測熒光探針DHE購自江蘇凱基生物技術股份有限公司；全蛋白提取、BCA法蛋白定量測定試劑盒及DAB顯色試劑盒購自南京建成生物技術有限公司；TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒(顯色法)、超敏ECL化學發光試劑盒購于上海碧云天生物技術研究所；抗iNOS、HO-1、Bax、cleaved-Caspase3及GAPDH鼠一抗和山羊抗鼠IgG二抗均購自Abcam。

1.2方法

1.2.1尿源性膿毒血癥動物模型的構建 40只新西蘭大耳白兔隨機分為對照組(Control)、假手術組(Sham)、尿源性膿毒血癥模型組(Model)、H2S供體NaHS處理組(8.4 μmol/kg NaHS)和H2S合成酶抑制劑DL-炔丙基甘氨酸處理組(37.5 mg/kg PAG)，每組8只。對照組8只白兔給予正常飼料和水喂養，不做處理。采用腎盂高壓法模擬臨床上尿路梗阻并感染構建尿源性膿毒血癥動物模型[7]。造模前腹腔注射戊巴比妥鈉(30 mg/kg)麻醉動物，假手術組白兔麻醉后左下腹腹直肌旁切口打開，腹腔分離出左輸尿管中段，腸管復位后關閉并縫合切口。其余3組共24只白兔麻醉后分離并結扎左側輸尿管中段，將108ml-1濃度的大腸桿菌懸液注入輸尿管管腔內，注射濃度為0.5 kg/ml。NaHS處理組在造模后經耳緣靜脈按8.4 μmol/kg劑量注射50 mmol/L的NaHS溶液；PAG處理組在造模后經耳緣靜脈按37.5 mg/kg劑量注射PAG溶液；模型組則注射等量生理鹽水。所有白兔術后給予正常顆粒飼料和水喂養。術后72 h 將所有白兔安樂死，動脈取血，取適量腎臟組織固定于4%多聚甲醛中用于組織病理學檢測以及取適量置EP管中保存于-80℃備用。

1.2.2腎組織HE染色 取適量4%多聚甲醛固定48 h的腎臟組織,石蠟包埋制作病理切片(厚度3～5 μm)。將石蠟切片經脫蠟、蘇木精染色、分化以及藍化后伊紅染色、洗滌脫水以及透明后封片。使用光學顯微鏡觀察組織變化情況并攝片。

1.2.3血液指標檢測 各組白兔靜脈取血5 ml，3 000 r/min，離心10 min，取上清。使用全自動生化分析儀檢測腎功能，即血肌酐(Serum creatinine，Scr)和尿素氮(Blood urea nitrogen，BUN)水平。使用酶聯免疫吸附測定實驗(ELISA)檢測血清中炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α水平。

1.2.4腎組織ROS水平檢測 按說明書操作，以DMSO溶解ROS檢測熒光探針DHE為5 mmol/L的溶液，避光放置備用；取凍存的腎組織用冰凍切片機，切片(厚度5～6 μm)；制片后，按1∶1 000的比例將稀釋好的探針溶液滴加到組織中，37℃孵育30 min；磷酸鹽緩沖液(PBS)洗去多余探針溶液，用抗熒光淬滅劑封片；熒光顯微鏡下，用藍光激發，觀察和拍攝細胞紅色發散圖像，ROS陽性細胞在整個核區被染成紅色；比較各組腎組織ROS陽性細胞相對熒光強度(間接反映ROS水平)。

1.2.5TUNEL染色 取適量4%多聚甲醛固定48 h的腎臟組織，用流水沖洗，去除殘留的固定液和雜質；梯度濃度的乙醇逐級脫水；依次經透明、浸蠟、包塊后切片機上進行切片(厚度為4～5 μm)；將切好的片子依次進行TUNEL染色處理：烤片和脫蠟；水化；蛋白酶K工作液常溫孵育15～30 min；滴加50 μl TUNEL反應混合液于樣品上，在濕盒、暗室中37℃避光孵育60 min；用PBS沖洗3次；加入50 μl轉化劑POD于樣品上，在濕盒中37℃避光孵育30 min；用PBS沖洗3次；加入100 μl DAB底物，于15℃～25℃孵育10 min；用PBS沖洗3次；蘇木素復染、脫水、透明；封片，光鏡下觀察凋亡細胞并統計。

1.2.6Western blot檢測蛋白表達 取-80℃凍存的腎組織，采用組織全蛋白提取試劑盒分別進行蛋白提取；用BCA蛋白濃度檢測試劑盒對所提蛋白進行濃度檢測；取20 μg蛋白和4 μl 2×SDS上樣緩沖液混合均勻，100℃變性10 min；上樣，SDS-PAGE凝膠電泳分離后轉至PVDF膜上；用5%脫脂牛奶封閉1 h；PBS洗膜；PBS洗膜后分別加入一抗(iNOS，1∶1 000；HO-1，1∶1 000；Bax，1∶2 000；cleaved Caspase3，1∶2 000及GAPDH，1∶1 000)在4℃下孵育過夜；PBS洗膜；加入HRP標記的二抗IgG(1∶5 000)室溫孵育0.5 h；PBS洗膜；用ECL化學發光進行顯色。以GAPDH為內參蛋白，采用Quantity One圖像處理軟件對各指標灰度值進行半定量分析。

2 結果

2.1NaHS對尿源性膿毒血癥兔腎臟組織病理學的影響 藥物干預72 h后，對照組和假手術組兔腎臟組織結構完整，無典型病理學損傷，無充血以及炎癥細胞浸潤。模型組兔腎小球嚴重變形，腎曲小管濁腫變形壞死，腎小管管腔變大，腎間質充血、大量炎癥細胞浸潤。與模型組比較，NaHS處理后上述變化顯著減輕，而經PAG處理后的兔腎組織病理學損傷進一步加重。見圖1。

2.2NaHS處理顯著改善尿源性膿毒血癥兔腎功能 藥物干預72 h后，對照組與假手術組兔血清BUN和Scr水平無顯著差異；模型兔血清中BUN和Scr水平顯著高于假手術組(P<0.01)；與模型組比較，NaHS處理后兔血清中BUN和Scr水平顯著降低(P<0.01)，而PAG處理后兔血清中BUN和Scr水平顯著升高(P<0.05)。見表1。

2.3NaHS處理顯著抑制尿源性膿毒血癥兔炎癥反應 藥物干預72 h后，對照組與假手術組兔血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平無顯著差異；模型兔血清中IL-1β、IL-6、TNF-α水平顯著高于假手術組(P<0.01)；與模型組比較，NaHS處理后兔血清中IL-1β、IL-6、TNFα水平顯著降低(P<0.01)，而PAG處理后兔血清中IL-6、TNF-α水平進一步升高(P<0.05)。見表2。

2.4NaHS處理顯著抑制尿源性膿毒血癥兔腎組織ROS釋放 藥物干預72 h后，對照組與假手術組兔腎組織ROS水平無顯著差異；模型組兔腎組織ROS水平顯著高于假手術組(P<0.01)；與模型組比較，NaHS處理后兔腎組織ROS水平顯著降低(P<0.01)，而PAG處理后兔腎組織ROS水平進一步升高(P<0.01)。見圖2。

圖1 HE染色檢測兔腎臟組織病理學變化(×200)Fig.1 Histopathological changes of rabbit kidney were observed by HE staining (×200)Note: PAG.DL-Propargylglycine.

GroupsBUN (mmol/L)Scr (μmol/L)Control3.84±0.5245.61±3.24Sham3.97±0.4747.04±4.05Model12.34±0.621)104.35±6.711)Model+NaHS7.15±0.512)68.75±5.122)Model+PAG15.87±0.663)127.89±5.783)

Note:1)P<0.01 vs sham group;2)P<0.01,3)P<0.05 vs model group.

GroupsIL-1βIL-6TNF-αControl47.22±4.5631.45±3.27101.87±6.47Sham48.59±4.2733.46±2.89105.64±5.99Model156.13±8.781)166.78±9.041) 378.56±25.641)Model+NaHS101.25±5.372)97.48±5.782) 214.36±18.482)Model+PAG167.48±9.17 190.73±11.783)419.61±3413)

Note:1)P<0.01 vs sham group;2)P<0.01，3)P<0.05 vs model group.

圖2 熒光顯微鏡觀察兔腎組織ROS水平(×200，n=3)

Fig.2 ROS level of rabbit kidney tissue was determined by immunofluorescence (×200,n=3)

Note: **.P<0.01 vs sham group;##.P<0.01 vs model group.

圖3 TUNEL染色檢測兔腎組織細胞凋亡(×200，n=3)

Fig.3 TUNEL assay detected apoptosis in rabbit kidney tissue cells (×200,n=3)

Note: **.P<0.01 vs sham group;##.P<0.01 vs model group.

2.5NaHS處理顯著抑制尿源性膿毒血癥兔腎組織細胞凋亡 藥物干預72 h后，對照組與假手術組兔腎組織細胞凋亡水平無顯著差異；模型組兔腎組織細胞凋亡率顯著高于假手術組(P<0.01)；與模型組比較，NaHS處理后兔腎組織細胞凋亡率顯著降低(P<0.01)，而PAG處理后兔腎組織細胞凋亡率進一步升高(P<0.01)。見圖3。

2.6iNOS/HO-1/Bax/Caspase3軸參與NaHS對膿毒血癥腎損傷的保護作用 藥物干預72 h后，對照組與假手術組兔腎組織各指標蛋白水平無顯著差異；模型組兔腎組織iNOS、HO-1、Bax及cleaved-Caspase3蛋白水平顯著高于假手術組(P<0.01)；

圖4 兔腎組織中iNOS、HO-1、Bax和cleaved Caspase 3蛋白水平的變化Fig.4 Changes in iNOS,HO-1,Bax and cleaved Caspase 3 protein levels in rabbit kidney tissuesNote: **.P<0.01 vs sham group;#.P<0.05,##.P<0.01 vs model group.

與模型組比較，NaHS處理后兔腎組織iNOS、Bax及cleaved-Caspase3蛋白水平顯著降低(P<0.05，P<0.01)，HO-1蛋白水平顯著升高(P<0.01)；而PAG處理后兔腎組織iNOS、Bax及cleaved-Caspase3蛋白進一步升高(P<0.01)，HO-1蛋白水平顯著降低(P<0.01)。見圖4。

3 討論

膿毒血癥是指機體被致病菌所感染、致病菌進而產生一系列毒素并被釋放到機體的血液循環中，激活內皮細胞等防御系統，誘導全身性炎癥反應的綜合征[8]。其中，AKI是膿毒血癥的臨床常見并發癥，其可導致患者住院時間延長，死亡率增加，加重病患家庭的經濟及心理負擔。目前，膿毒血癥所致AKI的發病機制尚不明確，但大多數研究認為膿毒血癥并發AKI與血流動力學的改變、炎癥介質、內毒素、免疫抑制和細胞凋亡所致的機體功能紊亂等因素密切相關，而炎癥反應被認為是眾多致病因素的核心因素[9]。抑制機體以炎癥為主所介導的一系列免疫反應可能為有效治療膿毒血癥AKI提供新的治療策略。

H2S是繼NO和CO后的第3個氣體信號分子，具有廣泛的生物學效應，如對抗缺血性損傷、減輕氧化應激損傷、抑制細胞凋亡和減輕炎癥反應等，其在多種疾病狀態中顯示了極大的治療性應用前景[10]。本研究中膿毒血癥兔造模72 h后血清BUN、Scr濃度顯著升高，說明兔腎功能受到損傷，提示膿毒血癥造模成功；腎組織損傷的典型病理學變化及血清中顯著提升的炎癥因子水平說明發生了AKI。此外，氧化應激反應發生顯著，表現為ROS水平顯著升高；腎組織細胞凋亡率明顯上升，細胞功能受損。經H2S供體NaHS治療后的膿毒血癥兔腎功能得到明顯改善，炎癥因子水平明顯降低，氧化應激反應緩解，細胞凋亡得到抑制，病變的腎組織學形態趨于正常。而經H2S合成酶抑制劑PAG處理的膿毒血癥兔腎組織損傷情況進一步加重。提示外源性NaHS進入機體后補償生成H2S發揮生理學效應對抗腎損傷，而PAG進入血液循環后則抑制了機體H2S的生成加重腎損傷。說明H2S的適當補充對膿毒血癥所致AKI具有顯著的治療作用。

iNOS為非Ca2+依賴型一氧化氮合酶，在正常生理情況下無活性表達，病理狀態下可在內毒素及多種細胞因子誘導后高表達，催化機體產生大量的內源性NO，對細胞產生毒副作用，影響細胞的代謝及功能[11]。HO-1是HO唯一的誘導型，又稱為熱休克蛋白，其能催化血紅素降解產生游離二價鐵離子、CO和膽綠素/膽紅素，在體內發揮抗氧化和抗炎作用[12]。研究顯示H2S與機體其他信號分子NO和CO的調控存在相互作用。例如，陳濤等[13]證實外源性H2S對阿爾茲海默癥大鼠海馬iNOS/NO體系具有抑制作用，而對HO-1/CO體系有激活效應。而在心肌炎小鼠模型中，Hua等[14]發現H2S所發揮的保護作用同樣與下調iNOS、上調HO-1的表達有關。在Ⅰ型糖尿病大鼠模型中，H2S干預明顯減輕了腎超微結構損傷，其機制被證實與有效降低iNOS蛋白表達有關[15]。而本研究中的Western blot結果顯示，H2S干預同樣下調iNOS并上調了HO-1的表達。此外，H2S所介導的抗細胞凋亡作用在多種疾病模型中被發現。例如，在腎臟缺血/再灌注損傷模型中，H2S在一定程度上保護了損傷腎組織，通過減輕氧化應激反應抑制腎組織細胞的凋亡[16]。在大鼠心臟停搏模型中，H2S可以抑制心臟停搏模型大鼠自主循環恢復后神經元自噬，減少神經元凋亡，改善神經功能[17]。在大鼠腸缺血/再灌注損傷模型中，H2S被證明通過下調ERK的mRNA表達及磷酸化，上調JNK、p38MAPK mRNA的表達，促進JNK、p38MAPK、NF-κB磷酸化，從而減輕損傷大鼠的回腸上皮細胞凋亡[18]。而本研究顯示，H2S對于腎組織細胞凋亡同樣具有一定的抑制作用，其機制可能與降低氧化應激，抑制凋亡信號通路Bax/Caspase3有關。

綜上，H2S對尿源性膿毒血癥誘導的AKI有一定的保護作用，其作用機制可能與有效調控iNOS/HO-1/Bax/Caspase3軸減少炎癥因子、iNOS的表達及ROS的釋放、促進HO-1表達，進而抑制損傷腎組織的細胞凋亡有關。