桑黃素對脂多糖誘導的急性肺損傷大鼠的保護作用研究①

楊 莉 郟建臣 王玉華 劉紅玲 申振亞

(河南科技大學第一附屬醫院開元院區急診科，洛陽471023)

急性肺損傷(Acute lung injury，ALI)是指除心源性之外的致病因素，如膿毒癥、再灌注損傷、失血性休克、煙霧及有毒氣體吸入等病因引起的急性進行性呼吸衰竭[1]。其病理多表現為肺泡毛細血管及肺泡上皮細胞損傷，肺泡水腫、炎癥浸潤并充滿富含蛋白質的液體，形成透明膜并出現肺間質纖維化現象[2]。近年來ALI發病率居高不下，病死率高達50%[3]。現階段，對ALI癥狀多采用呼吸支持療法并伴用鎮靜止痛藥，但其不能從根本上減輕ALI導致的病理損傷。因此，尋找減輕ALI病理損傷的有效方法對降低ALI病死率十分重要。研究表明，桑黃素(Morin)可通過降低NOD樣受體NLRP3炎癥小體產生抑制炎癥反應的發生，減輕ALI導致的病理損傷[4]。作為一類抗炎藥物，桑黃素還可通過阻礙NF-κB信號通路抑制多種組織細胞炎癥反應的發生[5,6]。據報道，NF-κB信號通路在脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)誘導的ALI中被過度激活，并誘導促炎癥因子的產生，阻礙NF-κB信號通路有助于減輕ALI病理損傷[7]。目前在ALI中，還沒有關于桑黃素與NF-κB信號通路作用機制的報道。因此本文通過建立體內外ALI模型，探究桑黃素對NF-κB信號通路的作用及此機制對ALI的影響，為尋找ALI有效治療方法提供了新的思路。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1脂多糖、桑黃素及胰島素樣生長因子(Insulin-like growth factor，IGF-1)購自美國Sigma；HE染色試劑盒、Tunel細胞凋亡檢測試劑盒、CCK8試劑盒及BCA試劑盒購自上海碧云天；腫瘤壞死因子(Tumor necrosis factor，TNF-α)、IL-6、IL-1β、ELISA試劑盒、Trizol試劑購自美國Invitrogen；購自美國Invirtrogen；超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)及丙二醛(Malondialdehyde，MDA)試劑盒購自南京建成；酸化磷脂酰肌醇-3激酶(phosphoryl-ated phosphatidylinositol 3-kinase，p-PI3K)、磷酸化絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶(phosphoryl-ated serine-threonine protein kinase，p-Akt)及3-磷酸甘油醛脫氫酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydro-genase,GAPDH)抗體購自美國Cell Signaling Technology；磷酸化NF-κB(p-IκBα)及NF-κB p65抗體購自美國Santa Cruz；PCR引物利用Primer 3網站設計，由北京六合華大基因合成；反轉錄試劑盒及實時定量PCR試劑盒購自美國Thermo Fisher；實驗所用二抗均購自北京中杉金橋。

1.2方法

1.2.1大鼠分組及ALI模型的建立 將大鼠分為Control、LPS、morin(10 mg/kg)、morin(20 mg/kg)及morin(40 mg/kg)組。腹腔注射LPS(10 mg/kg)誘導大鼠產生ALI，Control組除外。給藥組隨后腹腔注射相應濃度的桑黃素，Control及LPS組注射等量的生理鹽水。7 d后處死各組大鼠，收集大鼠外周血及肺組織，稱量右肺干濕重并計算肺干濕重比，將組織進行石蠟包埋，用于后期檢測。

1.2.2HE染色檢測肺損傷情況 將組織切片脫蠟，蘇木精染色液中處理10 min，洗滌后伊紅復染，脫水后封片。顯微鏡觀察切片，藍紫色為細胞核，紅色為細胞質及細胞外基質。

1.2.3Tunel檢測肺組織凋亡細胞百分比 組織切片脫蠟及修復后，利用內源性過氧化物酶封閉5 min。PBS洗滌，滴加Tunel檢測液37℃避光孵育60 min。PBS洗滌，滴加DAB顯色液進行顯色，并利用蘇木精復染，于暗室顯微鏡觀察切片，棕色為凋亡細胞，藍色為正常細胞。

1.2.4ELISA檢測炎癥因子TNF-α、IL-6和IL-1β的濃度 各組大鼠外周血清中TNF-α、IL-6和IL-1β的濃度測定步驟參考Invitrogen ELISA試劑盒說明書。避光顯色后，利用酶標儀檢測各組樣品OD值，按說明書公式計算其濃度。

1.2.5CCK8檢測大鼠原代肺巨噬細胞活性 將分離得到的大鼠原代肺巨噬細胞以1×105個/ml的濃度接于6孔板后培養24 h，然后分別用0、10、20、50、100、200 μmol/L的桑黃素處理細胞，24 h后檢測細胞存活率。選取存活率≥80%、梯度較高的作為用藥濃度。

1.2.6細胞分組處理及培養 將大鼠原代肺巨噬細胞分為Control、LPS、morin(10 μmol/L)、morin(20 μmol/L)、morin(50 μmol/L)及morin(50 μmol/L)+IGF-1組，LPS(1 μg/ml)誘導細胞損傷，Control組除外。給藥組細胞用相應濃度桑黃素處理，morin(50 μmol/L)+IGF-1組用50 μmol/L桑黃素及0.1 μg/ml IGF-1共同處理。細胞用含10%FBS、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的RPMI1640進行培養，細胞培養箱條件為5%CO2、37℃。

1.2.7RT-PCR檢測TNF-α、IL-6和IL-1β的mRNA水平 將1.2.6中各組細胞中加入Trizol，在通風櫥內進行總RNA抽提，步驟參考總RNA提取試劑盒說明書。定量分析后，進行反轉錄，每組取等量的RNA 反轉錄為cDNA，步驟參考反轉錄試劑盒說明書。最后利用RF PCR試劑盒對各樣品進行定量分析。

1.2.8免疫印跡檢測蛋白表達 RIPA裂解

1.2.1中各組肺組織及1.2.6中各組細胞，進行蛋白提取。BCA試劑盒定量并調平各組濃度。取各組蛋白30 μg，通過10%SDS-PAGE將蛋白分離，半干轉膜法將蛋白轉移到PVDF膜上。牛奶室溫封閉2 h，一抗4℃過夜，二抗37℃孵育1 h，曝光顯色，以GAPDH為內參。

1.3統計學分析 本文實驗數據通過統計軟件SPSS17.0進行分析。先進行正態分布分析和方差齊性分析，符合條件的選用單因素方差分析或t檢驗，不符合條件的選用秩和檢驗。P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1桑黃素對ALI大鼠肺水腫的影響 與Control組比較，LPS組大鼠肺干濕重比值顯著升高(P<0.01，圖1)，與LPS組比較，morin(10 mg/kg)、morin(20 mg/kg)及morin(40 mg/kg)組中大鼠肺干濕重比值顯著降低(P<0.05，P<0.01，圖1)。表明桑黃素可抑制ALI中的肺水腫。

2.2桑黃素對ALI大鼠組織病理變化的影響 Control組中大鼠肺組織規則正常，肺泡清晰且結構完整。與Control組比較，LPS組大鼠肺組織雜亂無序，肺泡壁增厚，肺泡中炎癥細胞浸潤，充滿紅細胞及蛋白滲出物，肺泡結構被破壞。與LPS組比較，morin(10 mg/kg)組大鼠肺泡中紅細胞及蛋白滲出物有所減少，肺泡結構破壞有所減輕；morin(20 mg/kg)組大鼠肺泡中炎癥細胞浸潤、紅細胞及蛋白滲出物顯著減少；morin(40 mg/kg)組大鼠肺組織排列有序，肺泡壁變薄，肺泡中炎癥浸潤及滲出物顯著減少，肺泡結構趨于正常。表明桑黃素可改善ALI引起的病理變化(圖2)。

2.3桑黃素對ALI大鼠組織細胞凋亡的影響 與Control組比較，LPS組大鼠肺組織中凋亡細胞百分比顯著升高(P<0.01，圖3)。與LPS組比較，morin(10 mg/kg)、morin(20 mg/kg)及morin(40 mg/kg)組中凋亡細胞百分比顯著降低(P<0.05，P<0.01，圖3)。此外，與Control組比較，LPS組大鼠肺組織中Bcl-2的表達顯著減少，Bax及cleaved Caspase-3的表達顯著增加(P<0.01，圖4)。與LPS組比較，morin(10 mg/kg)、morin(20 mg/kg)及morin(40 mg/kg)組中Bcl-2的表達顯著增加，Bax及cleaved Caspase-3的表達顯著減少(P<0.05，P<0.01，圖4)。實驗結果表明，桑黃素可減輕ALI引起的細胞凋亡。

圖1 各組大鼠中的肺干濕重比值Fig.1 Ratio of lung wet/dry weight in rat of each groupNote: n=6.**.P<0.01 versus control group；#.P<0.05,##.P<0.01 versus LPS group.

圖2 各組大鼠肺組織的病理變化Fig.2 Pathology of lung tissue in rat of each group

圖3 各組大鼠肺組織中的凋亡細胞百分比Fig.3 Apoptosis rate of cells in rat lung tissue of each groupNote: n=6.**.P<0.01 versus control group；#.P<0.05,##.P<0.01 versus LPS group.

2.4桑黃素對ALI大鼠炎癥反應的影響 與Control組比較，LPS組大鼠外周血清中炎癥因子TNF-α、IL-6和IL-1β的濃度顯著升高(P<0.01，圖5)。與LPS組比較，morin(10 mg/kg)、morin(20 mg/kg)及morin(40 mg/kg)組中TNF-α、IL-6和IL-1β的濃度顯著降低(P<0.05，P<0.01，圖5)。表明桑黃素可抑制ALI引起的炎癥反應。

2.5桑黃素對ALI大鼠組織氧化應激的影響 與Control組比較，LPS組大鼠肺組織中SOD濃度顯著下降，MDA濃度顯著上升(P<0.01，圖6)。與LPS組比較，morin(10 mg/kg)、morin(20 mg/kg)及morin(40 mg/kg)組中SOD濃度顯著上升，MDA濃度顯著下降(P<0.05，P<0.01，圖6)。表明桑黃素可減輕ALI引起的氧化應激。

圖4 各組大鼠肺組織中Bcl-2、Bax及cleaved Caspase-3的表達水平Fig.4 Expression level of Bcl-2,Bax and cleaved Caspase-3 in rat lung tissue of each groupNote: n=6.**.P<0.01 versus control group；#.P<0.05,##.P<0.01 versus LPS group.

圖5 各組大鼠外周血清中TNF-α、IL-6和IL-1β的濃度Fig.5 Concentration of TNF-α,IL-6 and IL-1β in rate serum of each groupNote: n=6.**.P<0.01 versus control group,#.P<0.05,##.P<0.01 versus LPS group.

2.6桑黃素對ALI大鼠組織中PI3K/Akt/NF-κB信號通路的影響 與Control組比較，LPS組大鼠肺組織中p-PI3K、p-Akt、p-IκBα和NF-κB p65表達水平顯著升高(P<0.01，圖7)。與LPS組比較，morin(10 mg/kg)、morin(20 mg/kg)及morin(40 mg/kg)組中p-PI3K、p-Akt、p-IκBα和NF-κB p65表達水平顯著降低(P<0.05，P<0.01，圖7)。表明桑黃素可抑制ALI組織中PI3K/Akt/NF-κB信號通路的激活。

2.7桑黃素對大鼠原代肺巨噬細胞存活率的影響 當桑黃素濃度達到100 μmol/L時，大鼠原代肺巨噬細胞存活率低于80%。故設置桑黃素用藥濃度為10、20、50 μmol/L，用于后續實驗(圖8)。

2.8桑黃素對ALI大鼠原代肺巨噬細胞中炎癥因子的影響 與Control組比較，LPS組大鼠原代肺巨噬細胞培養上清中TNF-α、IL-6和IL-1β的mRNA水平顯著升高(P<0.01，圖9)。與LPS組比較，morin(10 μmol/L)組差異無顯著統計學意義；morin(20 μmol/L)及morin(50 μmol/L)組中TNF-α、IL-6和IL-1β的mRNA水平顯著降低(P<0.01，圖9)。表明桑黃素可抑制ALI中肺巨噬細胞產生TNF-α、IL-6及IL-1β。

圖6 各組大鼠肺組織中的SOD及MDA濃度Fig.6 Concentration of SOD and MDA in rat lung tissue of each groupNote: n=6.**.P<0.01 versus control group；#.P<0.05,##.P<0.01 versus LPS group.

圖7 各組大鼠肺組織中p-PI3K、p-Akt、p-IκBα和NF-κB p65的表達水平Fig.7 Expression of p-PI3K,p-Akt,p-IκBα and NF-κB p65 in rat lung tissue of each groupNote: n=6.**.P<0.01 versus control group；#.P<0.05,##.P<0.01 versus LPS group.

2.9桑黃素對ALI大鼠原代肺巨噬細胞PI3K/Akt/NF-κB信號通路的影響 與Control組比較，LPS組大鼠原代肺巨噬細胞中p-PI3K、p-Akt、p-IκBα和NF-κB p65表達水平顯著升高(P<0.01，圖10)。與LPS組比較，morin(10 μmol/L)、morin(20 μmol/L)及morin(50 μmol/L)組中p-PI3K、p-Akt、p-IκBα和NF-κB p65表達水平顯著降低(P<0.05，P<0.01，圖10)。表明桑黃素可抑制ALI中肺巨噬細胞PI3K/Akt/NF-κB信號通路的激活。

2.10IGF-1減弱桑黃素對ALI大鼠原代肺巨噬細胞NF-κB活化的抑制作用 與Control組比較，LPS組大鼠原代肺巨噬細胞中p-IκBα和NF-κB p65的表達顯著增加。與LPS組比較，morin(50 μmol/L)組中p-IκBα和NF-κB p65的表達顯著減少。與morin(50 μmol/L)組比較，morin(50 μmol/L)+IGF-1組中p-IκBα和NF-κB p65的表達顯著增加(P<0.01，圖11)。IGF-1是PI3K/Akt信號通路的強效激活劑，表明PI3K/Akt信號通路激活可減弱桑黃素對ALI大鼠原代肺巨噬細胞中NF-κB活化的抑制作用。

圖8 不同濃度的桑黃素對大鼠原代肺巨噬細胞存活率的影響Fig.8 Effect of different morin concentration on rat pulmonary macrophage viabilityNote: n=6.

圖9 各組細胞上清中TNF-α、IL-6和IL-1β的mRNA水平Fig.9 mRNA level of TNF-α,IL-6 and IL-1β in cell supernatant of each groupNote: n=6.**.P<0.01 versus control group；##.P<0.01 versus LPS group.

圖10 各組細胞中p-PI3K、p-Akt、p-IκBα和NF-κB p65的表達水平Fig.10 Expression level of p-PI3K,p-Akt,p-IκBα and NF-κB p65 in cells of each groupNote: **.P<0.01 versus Control group；#.P<0.05,##.P<0.01 versus LPS group.

圖11 各組細胞中p-IκBα和NF-κB p65的表達水平Fig.11 Expression level of p-IκBα and NF-κB p65 in cells of each groupNote: **.P<0.01 versus control group；##.P<0.01 versus LPS group；&&.P<0.01 versus morin(50 μmol/L)group.

圖12 各組細胞培養上清中TNF-α、IL-6和IL-1β的mRNA水平Fig.12 mRNA level of TNF-α,IL-6 and IL-1β in cell supernatant of each groupNote: n=6,**.P<0.01 versus control group；##.P<0.01 versus LPS group；&&.P<0.01 versus morin(50 μmol/L) group.

2.11IGF-1減弱桑黃素對ALI大鼠原代肺巨噬細胞炎癥反應的抑制作用 與Control組比較，LPS組大鼠原代肺巨噬細胞培養上清中TNF-α、IL-6和IL-1β的mRNA水平顯著升高。與LPS組比較，morin(50 μmol/L)組中TNF-α、IL-6和IL-1β的mRNA水平顯著降低(P<0.01，圖12)。與morin(50 μmol/L)組比較，morin(50 μmol/L)+IGF-1組中TNF-α、IL-6和IL-1β的mRNA水平顯著升高。表明NF-κB的活化減弱桑黃素對ALI大鼠原代肺巨噬細胞炎癥反應的抑制作用。

3 討論

桑黃素(3,5,7,20,40-五羥黃酮)是一類黃體酮類化合物，可從密耳、杏仁殼及無花果等植物中分離得到。據報道，桑黃素具有多種生物學功能，可保護心血管細胞、腎小球細胞、肝細胞、少突膠質細胞及神經元細胞抵抗氧化應激損傷[8]。同時，桑黃素可通過阻礙NF-κB信號通路抑制多種組織細胞炎癥反應的發生[5,6]。而在ALI中，NF-κB信號通路被過度激活，促進肺組織炎癥反應的發生[7]。因此，本文探索了在ALI中桑黃素對NF-κB信號通路的作用，并檢測了此機制對ALI產生的影響。

在ALI中，肺組織細胞大量死亡，引起肺泡水腫及肺組織間質纖維化，因此，抵抗細胞凋亡、水腫及組織纖維化可緩解ALI造成的損傷。研究表明，桑黃素具有顯著的抗凋亡及抗纖維化作用，它可保護胃黏膜細胞避免吲哚美辛誘導的細胞凋亡，幫助肝細胞抵抗氧化應激誘發的細胞凋亡，并抑制二甲基亞硝胺誘導的肝組織纖維化[5,9,10]。本文研究發現，與Control組比較，LPS組大鼠肺干濕重比值顯著升高，肺泡中充滿紅細胞及蛋白滲出物。與LPS組比較，morin(10 mg/kg)、morin(20 mg/kg)及morin(40 mg/kg)組中大鼠肺干濕重比值顯著降低，肺泡中紅細胞及蛋白滲出物顯著減少。此外，桑黃素可降低ALI大鼠組織凋亡細胞百分比及Bax和cleaved Caspase-3的表達，升高Bcl-2的表達。同時，隨著桑黃素濃度由10 mg/kg升高至40 mg/kg，其產生的作用愈加明顯。LPS作為革蘭氏陰性菌細胞壁的重要組成部分，與肺損傷形成密切相關，常被用于建立ALI的動物模型，誘導肺部組織產生炎癥[11]。Bax作為一類促凋亡蛋白，可誘導Caspase-9和Caspase-3前體的激活[12]。cleaved Caspase-3作為Caspase-3的活化形式，是凋亡程序中的關鍵執行蛋白[13]。Bcl-2作為一類抗凋亡蛋白，可通過抑制Bax表達降低細胞凋亡水平[14]。實驗結果說明，桑黃素可減輕ALI導致的肺泡水腫及細胞凋亡，抑制肺組織纖維化的形成。

據報道，桑黃素具有顯著的抗炎作用，可抑制鉑類化合物引起的腎臟及肝臟炎癥反應，減輕哮喘導致的支氣管上皮細胞炎癥[15，16]。也有研究表明，桑黃素可顯著降低糖尿病模型大鼠腦組織中TNF-α、IL-1β及IL-6的產生[17]。TNF-α、IL-1β及IL-6均為促炎癥細胞因子，可刺激肺泡巨噬細胞和呼吸道上皮細胞釋放趨化因子，誘導單核巨噬細胞表達黏附分子，促進炎癥反應的發生[18]。此外，TNF-α和IL-1β還可誘導其他細胞炎癥因子的表達并激活NF-κB信號通路，進一步擴大炎癥反應的發展[19]。本文中，桑黃素降低ALI模型大鼠外周血清中TNF-α、IL-6和IL-1β的濃度及LPS處理后大鼠原代肺巨噬細胞上清中TNF-α、IL-6和IL-1β的mRNA水平。并且，隨著桑黃素濃度的升高，其對促炎癥細胞因子的抑制作用愈明顯。表明桑黃素可抑制ALI炎癥反應的發生發展。

研究表明，氧化應激是ALI發病機制的關鍵因素之一，可引起細胞內活性氧顯著增加，導致蛋白質、脂質及DNA發生硝化或氧化，造成肺組織損傷嚴重[20]。抑制氧化應激可減輕ALI產生的影響。據報道，桑黃素可抑制多種因素誘導的氧化應激，如在大鼠肝臟組織中，桑黃素可抑制環磷酰胺誘導的氧化應激[21]。在糖尿病模型小鼠腦組織中，桑黃素可抑制鏈脲霉素誘導的氧化應激[17]。同時，桑黃素還可保護細胞抵抗γ-輻射引起的氧化應激，減輕細胞膜脂過氧化現象及DNA損傷[22]。本文研究發現，與Control組比較，LPS組大鼠肺組織中SOD濃度顯著下降，MDA濃度顯著上升。與LPS組比較，morin(10 mg/kg)、morin(20 mg/kg)及morin(40 mg/kg)組中SOD濃度顯著上升，MDA濃度顯著下降，且隨著桑黃素濃度的升高，此效果愈明顯。SOD是機體內清除活性氧的主要酶類之一，可保護細胞膜結構完整，MDA是脂質的氧化產物，可作為檢測組織氧化損傷水平的指標[23]。實驗結果表明，桑黃素可減輕ALI氧化應激造成的病理損傷。

NF-κB信號通路在ALI中被過度激活，并參與肺組織炎癥反應的形成[7]。而桑黃素可抑制多種細胞中NF-κB信號通路的激活，并阻礙炎癥反應的發生，如在胃黏膜細胞中，桑黃素可通過抑制NF-κB信號通路保護細胞抵抗吲哚美辛誘導的炎癥反應和細胞凋亡[5]。在小鼠巨噬細胞中，桑黃素可通過阻礙NF-κB信號通路抑制尿酸鈉晶體誘導的炎癥免疫反應[6]。也有研究表明，在原代牛乳腺上皮細胞中，桑黃素可通過抑制NF-κB磷酸化降低促炎癥細胞因子TNF-α、IL-6和IL-1β的表達[24]。本文中，桑黃素可降低ALI模型大鼠肺組織及原代肺巨噬細胞中p-PI3K、p-Akt、p-IκBα和NF-κB p65的表達。并且隨著桑黃素濃度的升高，其產生的抑制作用越明顯。而當桑黃素與PI3K/Akt信號通路強效激活劑IGF-1共同作用于ALI模型原代肺巨噬細胞時，p-IκBα和NF-κB p65的表達水平顯著升高，TNF-α、IL-6和IL-1β的mRNA水平亦顯著升高。在PI3K/Akt信號通路中p-PI3K通過第二信使促使Akt活化，p-Akt通過磷酸化IκB激酶促使NF-κB激活，NF-κB p65是NF-κB的入核形式，對炎癥反應各階段中的細胞因子具有調節作用[25]。實驗結果提示，桑黃素可通過抑制PI3K/Akt/NF-κB信號通路降低ALI中TNF-α、IL-6和IL-1β的產生。

綜上所述，本文研究發現，桑黃素可緩解ALI導致的肺泡水腫及細胞凋亡，抑制肺組織纖維化的形成。同時，桑黃素可減輕ALI氧化應激造成的病理損傷。此外，桑黃素可通過阻礙PI3K/Akt/NF-κB信號通路降低TNF-α、IL-6和IL-1β的產生，抑制ALI中肺組織中炎癥反應的發生。本文深入研究了桑黃素對LPS誘導ALI大鼠的保護作用及機制，為桑黃素臨床應用提供理論基礎。