miR-21靶向調(diào)控Bcl-2對腸道上皮HT29細(xì)胞凋亡的影響及機(jī)制研究①

王衛(wèi)衛(wèi) 邢文韜 魏思忱 高巧營 魏新亮 石 亮 孔 郁

(滄州市中心醫(yī)院消化內(nèi)二科，滄州061001)

潰瘍性結(jié)腸炎是炎癥性腸道疾病的主要類型之一，可引起人體過度免疫應(yīng)答，導(dǎo)致炎癥細(xì)胞因子大量產(chǎn)生，誘發(fā)腸道上皮細(xì)胞凋亡，臨床表現(xiàn)為直腸出血和嚴(yán)重腹瀉[1]。該病經(jīng)柳氮磺胺吡啶水楊酸制劑治療后仍易復(fù)發(fā)，嚴(yán)重者甚至進(jìn)行手術(shù)切除[2]。潰瘍性結(jié)腸炎難以根治且發(fā)病率逐年遞增[3]，而至今對其發(fā)病機(jī)制及致病因素仍不清楚，因此研究其發(fā)病機(jī)制顯得尤為迫切，更有助于尋找根治潰瘍性結(jié)腸炎的有效方法。研究表明，某些微小型RNA(microRNA，miRNA)在潰瘍性結(jié)腸炎組織中異常表達(dá)，miR-21是高度表達(dá)的miRNA之一[4]。在結(jié)腸腺癌細(xì)胞Caco-2細(xì)胞中，過表達(dá)的miR-21通過靶向Rho GTP酶RhoB破壞腸上皮屏障功能[5]。據(jù)報道，在胰島β細(xì)胞中，過表達(dá)的miR-21可抑制B細(xì)胞淋巴瘤/白血病基因-2(B-cell lymphoma/leukemia gene-2,Bcl-2)轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)生[6]。Bcl-2是一種抗凋亡因子，在多種癌癥中表達(dá)上調(diào)[7,8]。目前在潰瘍性結(jié)腸炎中還沒有關(guān)于miR-21與Bcl-2關(guān)系的研究，因此本文通過下調(diào)miR-21，探究在人腸上皮HT29細(xì)胞中miR-21對Bcl-2的作用機(jī)制和對細(xì)胞凋亡的影響，揭示潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)病機(jī)理，為該病臨床治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1試劑 Trizol、Lipidosome 2000購自美國Invitrogen公司。實時定量PCR試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Thermo Fisher公司。外源性TNF-α購自美國PeproTech公司。miR-21 inhibitor、miR-21mimic和Bcl-2 siRNA(si-Bcl-2)購自上海吉瑪生物科技公司。RPMI1640培養(yǎng)液、胎牛血清(FBS)購自美國Gibco公司。RIPA裂解液購自北京索萊寶生物公司。BCA試劑盒購自廣州永諾生物科技有限公司。青、鏈霉素和MTT購自上海碧云天生物技術(shù)研究所。所用引物由北京六合華大基因有限公司合成。增殖細(xì)胞核抗原(Proliferating cell nuclear antigen,PCNA)和Ki67 購自美國Santa Cruz公司。Cleavezd Caspase-3、Cleaved Caspase-9購自美國Cell Signaling Technology公司。3-磷酸甘油醛脫氫酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)和所有二抗購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。ELISA試劑盒購自美國Abbkine公司。英夫利昔單抗購自瑞士Cilg AG公司。

1.1.2組織與細(xì)胞 正常結(jié)腸組織與潰瘍性結(jié)腸炎組織由廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院提供，正常結(jié)腸組織捐獻(xiàn)者無慢性自身免疫性疾病史及癌癥家族史。人腸上皮HT29細(xì)胞由美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection,ATCC)提供。用補(bǔ)充有10%FBS、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞。培養(yǎng)條件為37℃、5%CO2。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞分組與轉(zhuǎn)染 將細(xì)胞分為HT29組、miR-21 inhibitor組、si-Bcl-2組和si-Bcl-2+miR-21 inhibitor組。將細(xì)胞以1×105個/ml接種于6孔板中，次日用10 ng/ml的TNF-α處理HT29細(xì)胞24 h，然后用miR-21 inhibitor轉(zhuǎn)染miR-21 inhibitor組細(xì)胞，si-Bcl-2轉(zhuǎn)染si-Bcl-2組細(xì)胞，si-Bcl-2和miR-21 inhibitor共同轉(zhuǎn)染si-Bcl-2+miR-21 inhibitor組細(xì)胞，轉(zhuǎn)染6 h后換液，繼續(xù)培養(yǎng)用于后續(xù)的檢測。HT29組細(xì)胞僅用TNF-α處理24 h，Opti-MEM 6 h，換液繼續(xù)培養(yǎng)用于后續(xù)的檢測。

1.2.2RT-PCR檢測miR-21和Bcl-2的mRNA水平 首先在通風(fēng)櫥中抽提各檢測樣品的總RNA，操作步驟參考Thermo Fisher總RNA提取試劑盒說明書。然后將各樣品總RNA進(jìn)行定量分析，每組取等量RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，操作步驟參考逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書。通過PCR擴(kuò)增后，用實時定量PCR試劑盒對各檢測樣品進(jìn)行定量分析。

1.2.3熒光素酶實驗 利用生物信息預(yù)測miR-21與Bcl-2之間的連續(xù)結(jié)合位點，利用PCR將 Bcl-2片段插入熒光素酶載體中作為野生型的Bcl-2質(zhì)粒(Bcl-2 wt)，將連續(xù)結(jié)合位點突變的Bcl-2片段插入熒光素酶載體中作為突變型的Bcl-2質(zhì)粒(Bcl-2 mut)。將miR-21與Bcl-2 wt或Bcl-2 mut同時轉(zhuǎn)染HT29細(xì)胞，6 h后換液，轉(zhuǎn)染24 h后檢測各組細(xì)胞的熒光素酶反應(yīng)強(qiáng)度。

1.2.4MTT檢測細(xì)胞生存情況 將1.2.1中各組細(xì)胞中加入濃度為5 mg/ml的MTT溶液，作用4 h后終止培養(yǎng)。用槍頭吸出大部分培養(yǎng)液后，將細(xì)胞培養(yǎng)板翻轉(zhuǎn)倒扣于濾紙上吸去殘余液體。加入二甲基亞砜低速震蕩10 min，充分溶解結(jié)晶物后，用酶聯(lián)免疫檢測儀在OD 490 nm處測量各組細(xì)胞的吸光度值。

1.2.5流式檢測細(xì)胞凋亡情況 將1.2.1中各組細(xì)胞中加入0.25%的胰蛋白酶進(jìn)行消化，收集細(xì)胞，用預(yù)冷后的磷酸鹽緩沖液洗滌3次。將細(xì)胞用結(jié)合緩沖液調(diào)整密度至1×106個/ml，取100 μl加入試管中，再加入5 μl Annexin V及10 μl PI避光孵育 15 min，利用流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞的凋亡率。

1.2.6ELISA檢測炎癥細(xì)胞因子的表達(dá) 收集1.2.1中各組細(xì)胞培養(yǎng)上清，采用雙抗體夾心ELISA法檢測各組細(xì)胞中IL-6、IL-1β和IL-8的表達(dá)。上清離心去除沉淀物，加入包被好抗體的微孔中，稀釋后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的檢測抗體，37℃孵育1 h。洗滌后加入底物，37℃避光孵育15 min，終止液進(jìn)行終止，利用酶標(biāo)儀在450 nm波長處測定各孔的OD值。操作步驟參考ELISA試劑盒說明書。

2 結(jié)果

2.1正常結(jié)腸組織及潰瘍性結(jié)腸炎組織中miR-21與Bcl-2的mRNA水平 與正常結(jié)腸組織比較，潰瘍性結(jié)腸炎組織中miR-21的mRNA水平顯著升高，Bcl-2的mRNA水平顯著降低(P<0.001，圖1)。與潰瘍性結(jié)腸炎組織比較，經(jīng)英夫利昔單抗治療的潰瘍性結(jié)腸炎組織中miR-21的mRNA水平顯著降低，Bcl-2的mRNA水平顯著升高(P<0.001)，提示miR-21上調(diào)和Bcl-2下調(diào)可能與潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)生發(fā)展有關(guān)。

2.2TNF-α影響miR-21和Bcl-2的mRNA水平 利用TNF-α處理腸上皮細(xì)胞HT29構(gòu)建了體外炎癥細(xì)胞模型，與未處理組比較，經(jīng)TNF-α處理后miR-21的mRNA水平顯著升高，Bcl-2的mRNA水平顯著降低(P<0.001，圖2)。提示miR-21上調(diào)和Bcl-2下調(diào)可能與TNF-α誘導(dǎo)的細(xì)胞炎癥過程有關(guān)。

2.3沉默miR-21表達(dá)可升高Bcl-2的mRNA水平 與空白HT29炎癥模型細(xì)胞比較，轉(zhuǎn)染scramble細(xì)胞中miR-21和Bcl-2的mRNA水平變化無顯著差異，轉(zhuǎn)染miR-21 inhibitor細(xì)胞中miR-21的mRNA水平顯著降低，Bcl-2的mRNA水平顯著升高(P<0.001，圖3)。實驗結(jié)果說明miR-21 inhibitor 轉(zhuǎn)染成功，并提示miR-21對Bcl-2有潛在調(diào)節(jié)作用。

2.4miR-21靶向結(jié)合Bcl-2 生物信息學(xué)分析結(jié)果表明 miR-21與Bcl-2之間存在連續(xù)結(jié)合片段。miR-21 mimic 顯著降低Bcl-2 wt質(zhì)粒的熒光素酶活性(P<0.01，圖4)，對結(jié)合片段核苷酸位點突變的Bcl-2 mut質(zhì)粒并無影響。實驗結(jié)果說明miR-21可以靶向結(jié)合Bcl-2并抑制Bcl-2的表達(dá)。

圖1 正常結(jié)腸組織及潰瘍性結(jié)腸炎組織中miR-21與Bcl-2的mRNA水平Fig.1 mRNA level of miR-21 and Bcl-2 in normal human colon tissues and ulcerative colitis tissuesNote: n=25,***.P<0.001 versus normal control group.

圖2 TNF-α對miR-21和Bcl-2的mRNA水平的影響Fig.2 Effect of TNF-α on mRNA level of miR-21 and Bcl-2Note: n=6,***.P<0.001 versus control group.

2.5miR-21 inhibitor上調(diào)Bcl-2的表達(dá) 與HT29組比較，miR-21 inhibitor組中Bcl-2的表達(dá)顯著上升(P<0.001，圖5)，si-Bcl-2組中Bcl-2的表達(dá)顯著下降(P<0.01，圖5)。同時，與miR-21 inhibitor組比較，si-Bcl-2+miR-21 inhibitor組中Bcl-2的表達(dá)顯著下降(P<0.001，圖5)。實驗結(jié)果說明si-Bcl-2 轉(zhuǎn)染成功，miR-21 inhibitor可通過抑制miR-21上調(diào)Bcl-2的表達(dá)。

2.6miR-21 inhibitor提高HT29細(xì)胞存活 對各組細(xì)胞的活力進(jìn)行了測定，與HT29組比較，miR-21 inhibitor組活細(xì)胞所占百分比顯著升高，si-Bcl-2組活細(xì)胞所占百分比顯著降低(P<0.001，圖6)。同時，與miR-21 inhibitor組比較，si-Bcl-2+miR-21 inhibitor組所占百分比顯著降低(P<0.001，圖6)。此外，與HT29組比較，miR-21 inhibitor組中細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白PCNA和Ki67的表達(dá)顯著增加(P<0.001，圖7)，si-Bcl-2組中PCNA和Ki67的表達(dá)顯著減少(P<0.001，P<0.01，圖7)。與miR-21 inhibitor組比較，si-Bcl-2+miR-21 inhibitor組中PCNA和Ki67的表達(dá)顯著減少(P<0.001，圖7)。實驗結(jié)果說明miR-21 inhibitor 可通過上調(diào)Bcl-2提高HT29細(xì)胞存活并誘導(dǎo)細(xì)胞增殖，提示miR-21可通過下調(diào)Bcl-2降低細(xì)胞存活。

圖3 miR-21 inhibitor對Bcl-2 mRNA水平的影響Fig.3 Effect of miR-21 inhibitor on mRNA level of Bcl-2Note: n=6,***.P<0.001 versus HT29 group.

圖4 miR-21與Bcl-2的靶向關(guān)系Fig.4 Targeted relationship between miR-21 and Bcl-2Note: n=6,**.P<0.01 versus Bcl-2 wt group.

2.7miR-21 inhibitor 抑制HT29細(xì)胞凋亡 與HT29組比較，miR-21 inhibitor組細(xì)胞凋亡率顯著下降(P<0.001，圖8)，si-Bcl-2組細(xì)胞凋亡率顯著上升(P<0.01，圖8)。同時，與miR-21 inhibitor組比較，si-Bcl-2+miR-21 inhibitor組細(xì)胞凋亡率顯著上升(P<0.001，圖8)。此外，與HT29組比較，miR-21 inhibitor組細(xì)胞凋亡執(zhí)行蛋白Cleaved Caspase-3和Cleaved Caspase-9的表達(dá)顯著減少(P<0.001，圖7)，si-Bcl-2組Cleaved Caspase-3和Cleaved Caspase-9的表達(dá)顯著增加(P<0.01， 圖7)。同時， 與miR-21 inhibitor組比較，si-Bcl-2+miR-21 inhibitor組Cleaved Caspase-3和Cleaved Caspase-9的表達(dá)顯著增加(P<0.001，圖7)。實驗結(jié)果說明miR-21 inhibitor 可通過上調(diào)Bcl-2抑制HT29細(xì)胞凋亡，提示miR-21可通過下調(diào)Bcl-2促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

圖5 miR-21 inhibitor 對Bcl-2表達(dá)的影響Fig.5 Effect of miR-21 inhibitor on expression of Bcl-2Note: n=6,**.P<0.01,***.P<0.001 versus HT29 group;###.P<0.001 versus miR-21 inhibitor group.

圖6 miR-21 inhibitor對HT29細(xì)胞存活的影響Fig.6 Effect of miR-21 inhibitor on HT29 cell viabilityNote: n=6,***.P<0.001 versus HT29 group;###.P<0.001 versus miR-21 inhibitor group.

圖7 miR-21 inhibitor 對HT29細(xì)胞表達(dá)PCNA、Ki67、cleaved Caspase-3和Cleaved Caspase-9蛋白的影響Fig.7 Effect of miR-21 inhibitor on expressions of PCNA,Ki67,Cleaved Caspase-3 and Cleaved Caspase-9 in HT29 cellsNote: n=6,**.P<0.01 ***.P<0.001 versus HT29 group;###.P<0.001 versus miR-21 inhibitor group.

圖8 miR-21 inhibitor 對HT29細(xì)胞凋亡的影響Fig.8 Effect of miR-21 inhibitor on HT29 cell apoptosisNote: n=6,**.P<0.01 ***.P<0.001 versus HT29 group;###.P<0.001 versus miR-21 inhibitor group.

2.8miR-21 inhibitor 降低HT29細(xì)胞上清中炎癥細(xì)胞因子的濃度 與HT29組比較，miR-21 inhibitor組中炎癥細(xì)胞因子IL-6、IL-1β、IL-8的濃度顯著降低(P<0.001，圖9)，si-Bcl-2組中IL-6、IL-1β、IL-8的濃度顯著升高(P<0.01，圖9)。同時，與miR-21 inhibitor組比較，si-Bcl-2+miR-21 inhibitor組中IL-6、IL-1β、IL-8的濃度顯著升高(P<0.001，圖9)。實驗結(jié)果說明miR-21 inhibitor 可通過上調(diào)Bcl-2抑制HT29細(xì)胞產(chǎn)生炎癥細(xì)胞因子，不利于炎癥反應(yīng)的發(fā)生，提示miR-21可通過下調(diào)Bcl-2促進(jìn)炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生，有助于炎癥反應(yīng)的發(fā)生。

圖9 miR-21 inhibitor 對HT29細(xì)胞產(chǎn)生IL-6、IL-1β和IL-8的影響Fig.9 Effect of miR-21 inhibitor on production of IL-6，IL-1β and IL-8 by HT29 cellsNote: n=6,**.P<0.01,***.P<0.001 versus HT29 group;##.P<0.01,###.P<0.001 versus miR-21 inhibitor group.

3 討論

miRNA是一類調(diào)節(jié)基因表達(dá)的小型單鏈非編碼RNA，在各種生物過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，比如細(xì)胞增殖、分化、發(fā)育和凋亡過程[9]。有研究表明，miRNA還參與炎癥發(fā)生過程[10]。如miR-21在潰瘍性結(jié)腸炎組織中高度表達(dá)，導(dǎo)致腸上皮屏障功能受損并促進(jìn)炎癥發(fā)生[5]。同時，miR-21在胰島β細(xì)胞中降低抗凋亡因子Bcl-2的轉(zhuǎn)錄和翻譯，促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。另外臨床研究表明，在潰瘍性結(jié)腸炎組織中腸道上皮細(xì)胞發(fā)生過度凋亡[3]。推測在潰瘍性結(jié)腸炎中miR-21可能與Bcl-2存在相互作用的關(guān)系，對炎癥發(fā)生起到調(diào)控作用。于是本文首先檢測了miR-21與Bcl-2在正常結(jié)腸組織及潰瘍性結(jié)腸炎組織、TNF-α未處理或處理的HT29細(xì)胞中的mRNA水平，發(fā)現(xiàn)在潰瘍性結(jié)腸炎組織和TNF-α處理后的HT29細(xì)胞中miR-21 mRNA水平顯著升高，Bcl-2 mRNA水平顯著降低。TNF-α是一類促炎細(xì)胞因子，在炎癥性腸道疾病中過度表達(dá)，并促進(jìn)腸道炎癥發(fā)生，抗TNF-α單克隆抗體可抑制潰瘍性結(jié)腸炎腸道上皮細(xì)胞過度凋亡[11]。實驗結(jié)果提示miR-21上調(diào)和Bcl-2下調(diào)可能與潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)生發(fā)展有關(guān)。

大多數(shù)情況下，miRNA往往通過介導(dǎo)靶基因mRNA切割、抑制mRNA翻譯或影響mRNA穩(wěn)定的方式對靶基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，下調(diào)miRNA可降低其對靶基因的調(diào)控。已有研究表明在其他組織或細(xì)胞如胰島β細(xì)胞中miR-21可靶向抑制Bcl-2的表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[6]。然而同樣有研究發(fā)現(xiàn)miR-21對Bcl-2表達(dá)的促進(jìn)作用，如miR-21可上調(diào)Bcl-2的表達(dá)，促進(jìn)心肌纖維化和心力衰竭[12]。可能是因為在不同的組織細(xì)胞中miR-21表現(xiàn)出了不同的作用。本文中利用miR-21 inhibitor下調(diào)miR-21的mRNA水平后，Bcl-2的mRNA水平顯著升高。提示miR-21對Bcl-2有潛在的調(diào)控作用。同時，生物信息預(yù)測兩者之間存在連續(xù)結(jié)合片段，通過熒光素酶報告實驗進(jìn)一步驗證，發(fā)現(xiàn)miR-21 mimic可顯著降低Bcl-2 wt質(zhì)粒的熒光素酶活性，但對結(jié)合片段核苷酸位點突變的Bcl-2 mut質(zhì)粒并沒有影響。說明miR-21對Bcl-2的確有調(diào)節(jié)作用，miR-21通過靶向結(jié)合Bcl-2而抑制Bcl-2的表達(dá)。此外，與單用TNF-α處理的HT29組比較，miR-21 inhibitor組中Bcl-2的表達(dá)顯著上升，si-Bcl-2組中Bcl-2的表達(dá)顯著下降。而與miR-21 inhibitor組比較，si-Bcl-2+miR-21 inhibitor組中Bcl-2的表達(dá)顯著下降。實驗結(jié)果說明si-Bcl-2轉(zhuǎn)染成功，miR-21 inhibitor可通過下調(diào)miR-21上調(diào)Bcl-2的表達(dá)，反向證明miR-21靶向下調(diào)Bcl-2。Bcl-2是一類抗凋亡蛋白，可作為癌癥發(fā)生的標(biāo)志蛋白[13]，它可幫助輔助性T細(xì)胞17避免糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[14]，并參與黏液細(xì)胞炎癥反應(yīng)的恢復(fù)過程[15]。

臨床檢測發(fā)現(xiàn)，潰瘍性結(jié)腸炎組織中炎癥細(xì)胞因子大量產(chǎn)生，腸道上皮細(xì)胞過度凋亡[16]。而研究表明，某些miRNA可通過調(diào)控靶蛋白抑制細(xì)胞存活并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。如在甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞中，miR-21通過抑制Bcl-2的表達(dá)降低細(xì)胞存活率并提高細(xì)胞凋亡率，抑制甲狀腺乳頭狀癌癥的發(fā)生發(fā)展[17]。在腸道上皮HT29細(xì)胞中，高度表達(dá)的miR-29a靶向下調(diào)抗凋亡家族蛋白Mcl-1的表達(dá)并導(dǎo)致細(xì)胞凋亡率升高，有利于潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)生發(fā)展[18]。在潰瘍性結(jié)腸炎組織中，腸道上皮細(xì)胞存活率降低且凋亡水平升高，導(dǎo)致腸道黏膜完整性被嚴(yán)重破壞，腸道炎癥反復(fù)發(fā)生。之前的研究報道了miR-21對潰瘍性結(jié)腸炎的促進(jìn)作用，然而miR-21對結(jié)腸細(xì)胞存活和凋亡的機(jī)制還未見報道[5]，本研究發(fā)現(xiàn)，在潰瘍性結(jié)腸炎組織中高度表達(dá)的miR-21靶向下調(diào)Bcl-2，于是進(jìn)一步對腸道上皮HT29細(xì)胞存活和凋亡情況進(jìn)行檢測。發(fā)現(xiàn)與單用TNF-α處理的HT29組比較，miR-21 inhibitor組細(xì)胞存活率及PCNA、Ki67的表達(dá)顯著上升，細(xì)胞凋亡率及Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9的表達(dá)顯著降低，si-Bcl-2組細(xì)胞存活率及PCNA、Ki67的表達(dá)顯著下降，細(xì)胞凋亡率及Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9的表達(dá)顯著上升。同時，與miR-21 inhibitor組比較，si-Bcl-2+miR-21 inhibitor組細(xì)胞存活率及PCNA、Ki67的表達(dá)顯著下降，細(xì)胞凋亡率及Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9的表達(dá)顯著上升。PCNA和Ki67在細(xì)胞周期調(diào)控中發(fā)揮重要作用，可作為檢測細(xì)胞活性的經(jīng)典指標(biāo)，其蛋白表達(dá)水平越高說明處于增殖時期的細(xì)胞越多，細(xì)胞存活能力越強(qiáng)[19,20]。Cleaved Caspase-3和Cleaved Caspase-9是細(xì)胞凋亡過程中的主要執(zhí)行者，可視為細(xì)胞凋亡級聯(lián)反應(yīng)中的標(biāo)志性蛋白[21,22]。實驗結(jié)果說明抑制miR-21表達(dá)可提高細(xì)胞的存活，降低細(xì)胞的凋亡。提示miR-21可降低腸道上皮HT29細(xì)胞存活并提高細(xì)胞凋亡。

在潰瘍性結(jié)腸炎組織中，炎癥細(xì)胞因子IL-6、IL-1β和IL-8大量產(chǎn)生，引起腸道上皮細(xì)胞大量死亡[23,24]。IL-6可介導(dǎo)髓樣相關(guān)蛋白9的表達(dá)，促進(jìn)其將免疫細(xì)胞募集到發(fā)炎的結(jié)腸組織中[25]。IL-1β可阻礙Ca2+的釋放，導(dǎo)致潰瘍性結(jié)腸炎患者的結(jié)腸平滑肌功能障礙[26]。IL-8可結(jié)合CXC趨化因子家族的G蛋白偶聯(lián)受體，啟動炎癥發(fā)生的級聯(lián)反應(yīng)[24]。臨床上往往通過檢測IL-6、IL-1β和IL-8水平來評判治療方法對潰瘍性結(jié)腸炎是否有效[27]。在本文中，與單用TNF-α處理的HT29組比較，miR-21 inhibitor組中IL-6、IL-1β、IL-8的表達(dá)水平顯著降低，si-Bcl-2組中IL-6、IL-1β、IL-8的表達(dá)水平顯著升高。同時，與miR-21 inhibitor組比較，si-Bcl-2+miR-21 inhibitor組中IL-6、IL-1β、IL-8的表達(dá)水平顯著升高。實驗結(jié)果說明，抑制miR-21表達(dá)可降低IL-6、IL-1β、IL-8的表達(dá)水平，阻礙炎癥的發(fā)展。提示miR-21可促進(jìn)IL-6、IL-1β、IL-8表達(dá)，有利于潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，miR-21可靶向結(jié)合并下調(diào)Bcl-2的表達(dá)，miR-21 inhibitor下調(diào)miR-21后可上調(diào)Bcl-2的表達(dá)，提高細(xì)胞的存活，降低細(xì)胞的凋亡，減少IL-6、IL-1β、IL-8的產(chǎn)生，阻礙腸道上皮HT29細(xì)胞炎癥的發(fā)展。提示miR-21可通過靶向下調(diào)Bcl-2，降低細(xì)胞存活，提高細(xì)胞凋亡，增加IL-6、IL-1β、IL-8的產(chǎn)生，促進(jìn)腸道上皮HT29細(xì)胞炎癥的發(fā)展。miR-21靶向下調(diào)Bcl-2促進(jìn)腸道上皮HT29細(xì)胞凋亡這一機(jī)制可能參與了潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)生發(fā)展過程，為尋找根治潰瘍性結(jié)腸炎的有效方法提供新的思路。而本研究僅僅通過HT29細(xì)胞研究了miR-21與Bcl-2的靶向關(guān)系及調(diào)控作用，具有一定的局限性，后期考慮構(gòu)建潰瘍性結(jié)腸炎體內(nèi)模型，進(jìn)一步研究miR-21和Bcl-2的作用機(jī)制。