螺內酯通過抑制左心室肥厚大鼠促肥大生長因子的表達和c-Raf/ERK1/2信號通路的活化來預防左心室肥厚

劉 紅 張維新 張玲燕

(河南省鄭州市中醫院內五科，鄭州450000)

左心室肥厚(Left ventricular hypertrophy，LVH)是心肌重塑的一個特征，是一種機體對動脈高血壓或主動脈瓣狹窄引起的壓力超負荷的補償機制。左心室肥厚是心律失常、猝死、舒張功能障礙和充血性心力衰竭的危險因素[1]。成人心肌細胞無法通過提高蛋白質合成速率來應對壓力和生長刺激，從而導致細胞體積增加。其他研究顯示，除心肌細胞肥大外，壓力超負荷也可導致間質細胞增殖和細胞外基質生成，以及血管周圍和間質膠原沉積增加[2]。壓力超負荷導致心臟組織中配體的局部釋放，包括生長因子如血小板源生長因子(Platelet-derived growth factor,PDGF)激活其酪氨酸激酶受體和轉化生長因子β(Transforming growth factor-β，TGF-β)激活其絲氨酸-蘇氨酸激酶受體[3,4]。多種信號轉導通路均涉及心肌細胞肥大的病理過程，其中包括絲氨酸-蘇氨酸激酶(c-Raf)及其下游分子絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinases，MAPK)的級聯反應[5,6]。細胞外信號調節激酶1/2(Extra-cellular signal-regulated kinases，ERK 1/2)是MAPK的一個亞組，在調節導致心肌肥厚的基因表達中發揮關鍵作用[7,8]。ERK 1/2的磷酸化與心臟轉錄因子c-myc和GATA4的上調有關[9]。GATA4是大多數心臟表達的結構基因和肥大相關基因的關鍵轉錄因子，其中包括心房利鈉肽(Atrial natriuretic peptide，ANP)基因[10,11]。在人類中，c-Raf的突變與遺傳性疾病如Noonan綜合征中的心臟肥大有關，這表明c-Raf在心臟肥大的病理生理調節中具有重要作用[12]。多項數據表明，腫瘤發生與調節心臟肥大的信號通路之間存在相似性，其中包括c-Raf/ERK1/2 信號通路[13-15]。眾所周知，醛固酮是一種可引起心肌肥厚的類固醇類激素，為腎素-血管緊張素系統的一部分[16]。螺內酯是一種醛固酮受體拮抗劑，多項研究均證實螺內酯可用于治療慢性心力衰竭、抑制快速心房起搏所致電重構、調節心肌膠原重建等作用[17-18]，最近動物實驗模型研究表明，螺內酯可預防由于異丙腎上腺素引起的心肌肥厚[19]。本研究旨在探討螺內酯對壓力超負荷誘導的左心室肥厚大鼠免疫及炎癥因子的影響，及其在左心室肥厚中的作用機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗材料 螺內酯購自江蘇正大豐海制藥有限公司(國藥準字：H32020077)； van Gieson染色液購自南京森貝伽生物科技有限公司；PDGF-BB和TGF-β1 ELISA試劑盒購自美國R&D Systems公司；組織裂解緩沖液購自瑞士Roche公司； BCA蛋白質測定試劑盒購自美國Pierce公司； RNeasy Mini試劑盒購自美國Qiagen公司； RNA逆轉錄試劑盒、MultiScribe逆轉錄酶、dNTP和RNase抑制劑、Applied Biosystems 7500實時PCR系統購自美國Applied Biosystems公司；Synergy Brands(SYBR)Premix Ex TaqTM試劑盒購自日本TaKaRa Holdingsn公司；Sircol Soluble Collagen Assay膠原蛋白檢測試劑盒購自英國Biocolor公司；兔抗大鼠磷酸化-ERK1/2、小鼠抗大鼠總ERK1/2、兔抗大鼠磷酸化c-Raf和兔抗大鼠總c-Raf抗體均購自R&D Systems公司；HRP-標記的二抗購自艾美捷科技有限公司；增強的化學發光ECL試劑盒購自美國Perkin-Elmer公司。

1.1.2實驗動物及分組 使用6～8周體重210～260 g的雄性SD大鼠(四川大學實驗動物中心)進行研究，嚴格按照國家衛生研究院實驗動物護理和使用指南中的建議進行實驗，本研究已獲得動物實驗倫理委員會批準。將40只大鼠隨機分為對照組(Control)、模型組(Model)、螺內酯組(Spironolactone)和假手術組(Sham)，每組10只。在本研究中，對照組大鼠為相同飼養條件下飼養但未進行建模的大鼠；模型組大鼠為建立壓力超負荷誘導的左心室肥厚模型的大鼠；螺內酯組大鼠為應用螺內酯處理的左心室肥厚模型大鼠；假手術組大鼠為只進行開腹手術操作但未進行腹主動脈縮窄絲線結扎的大鼠。

1.2方法

1.2.1動物模型建立 參考胡詠梅等文獻報道的方法[20]，采用腹主動脈縮窄法建立壓力超負荷誘導的左心室肥厚大鼠模型。所有手術均在2%戊巴比妥鈉腹腔麻醉下進行，在大鼠雙側腎動脈上方游離腹主動脈，在主動脈長軸旁平行放置直徑0.7 mm 的7號針頭，然后用絲線將腹主動脈及針頭捆扎在一起，然后抽出針頭，即可造成腹主動脈狹窄。假手術組未用絲線結扎，其他步驟與模型組相同。術后第4周對大鼠進行心臟超聲檢查，若舒張末期左室后壁厚度和舒張末期室間隔厚度明顯增加則證實形成左心室肥厚。

1.2.2治療方案 將20只建模后的大鼠隨機分為螺內酯組和模型組，每組各10只。對照組大鼠未做手術處理。將螺內酯溶于生理鹽水(0.9%NaCl)中，每天按照20 mg/kg的劑量對螺內酯組大鼠進行灌胃，根據大鼠體重計算螺內酯用量，將螺內酯溶解到2 ml生理鹽水中，然后對大鼠進行灌胃。為了排除溶劑對本試驗的影響，因此本研究對模型組、假手術組和對照組大鼠灌胃等體積(2 ml)的生理鹽水，共治療8周。最后一次灌胃后12 h內處死大鼠，收集血液和左心室組織用于后續分析。

1.2.3組織學分析 將左心室切除并快速固定在10%福爾馬林中，石蠟包埋。切片厚度為7 μm，將切片用van Gieson染色以檢測心室的膠原沉積[21]。在光學顯微鏡下觀察染色切片并用數碼相機拍照。

1.2.4PDGF-BB和TGF-β1的檢測 采用ELISA試劑盒檢測大鼠左心室PDGF-BB和TGF-β1的水平。將100 mg快速冷凍的左心室組織在500 μl含有50 mmol/L Tris HCl (pH 7.5)、150 mmol/L NaCl、10 mmol/L EDTA、0.25%Triton X-100、0.1%NP-40、1 mmol/L PMSF和cocktail蛋白酶抑制劑的裂解緩沖液中勻漿。裂解物在4℃下以14 000 g離心15 min。將ELISA水平標準化為每種樣品的總蛋白質水平。

1.2.5RT-qPCR 使用RNeasy Mini試劑盒從大鼠左心室心肌中提取總RNA。使用RNA逆轉錄試劑盒、MultiScribe逆轉錄酶(50 U/μl)、dNTP和RNase抑制劑(20 U/μl)反轉總RNA(2.5 μg)。通過Applied Biosystems 7500實時PCR系統和Synergy Brands(SYBR)Premix Ex TaqTM試劑盒進行RT-qPCR，反應體系為25 μl。引物序列如下：ANP，上游：5′- AGC TCA AGC GAG GTC GGA TG-3′，下游：5′- GGC TGC CTG TCC TGT TGG TT -3′。GATA4，上游：5′- CGA AAA GTC GAG GCC TCA AAC TTT G-3′，下游：5′- CGG CCA TGA AGC CAA TCC-3′。c-myc，上游：5′- AGC TCA GTC AGC AGG GAG TG-3′，下游：5′- GGC TGT GTT TGC CTG TCC TG-3′。GAPDH，上游：5′- TCG GGG TGA TGC CTC AAC CT-3′，下游：5′- CGC ACA GTG AAG GCT CAC T-3′。反應條件如下：95℃預變性10 min，95℃ 15 s，60℃ 60 s，40個循環，60℃延伸60 s。使用GAPDH作為內參基因。通過2-ΔΔCt法計算基因的相對表達量。

1.2.6膠原蛋白檢測 使用Sircol Soluble Collagen Assay膠原蛋白檢測試劑盒測定大鼠左心室勻漿中的總可溶性膠原。將1 ml天狼星紅染料加入到10 μl 心室勻漿中，并在室溫下孵育30 min。在12,000 g離心10 min后，將沉淀的膠原-染料復合物用1 ml 0.5 mol/L NaOH溶解，并在540 nm處讀取吸光度。定量結果表示為膠原蛋白與總蛋白含量的比值。

1.2.7蛋白質印跡分析 將大鼠心室組織在50 mmol/L Tris HCl (pH 7.5)、150 mmol/L NaCl、10 mmol/L EDTA、0.25%Triton X-100、0.1%NP-40、1 mmol/L PMSF和cocktail蛋白酶抑制劑中裂解。通過BCA蛋白質測定試劑盒測量蛋白質濃度。在SDS-聚丙烯酰胺凝膠上分離蛋白質(每個泳道100 μg)并轉移到硝酸纖維素膜上。室溫下將膜在含有0.1%吐溫20和5%脫脂乳的Tris緩沖鹽水(pH7.4)中封閉1 h，并在4℃下與以下一抗孵育過夜：兔抗大鼠磷酸化-ERK1/2 (1∶1 000)、小鼠抗大鼠總ERK1/2(1∶1 000)、兔抗大鼠磷酸化c-Raf(1∶1 000)和兔抗大鼠總c-Raf(1∶1 000)。將膜在含有0.1% Tween-20的TBS中洗滌1 h，并用HRP-標記的二抗(1∶2 000)在含有0.1%吐溫20和5%脫脂乳的TBS中孵育1 h。使用增強的化學發光ECL試劑盒進行顯影。

2 結果

2.1螺內酯可抑制壓力超負荷誘導的大鼠左心室肥厚 本研究通過大鼠左心室重量與體重比值(VW/BW)來評價螺內酯對壓力超負荷誘導的大鼠左心室肥厚的影響。將大鼠麻醉開胸后迅速去除心臟，首先用冰生理鹽水洗清，然后濾紙吸干水分，減去心房及血管組織，分別沿室間隔分離左心室，用電子天平稱取左心室重量。圖1顯示，模型組大鼠VW/BW(3.62±0.31 mg/kg)比對照組(2.65±0.23 mg/kg)顯著增加了36.60%，而螺內酯可顯著降低大鼠的VW/BW(2.78±0.24 mg/kg)(P<0.05)。

圖1 螺內酯對大鼠左心室重量與體重比值(VW/BW)的影響Fig.1 Effect of spironolactone on ratio of left ventricular weight to body weight (VW/BW) in ratsNote: Compared with the control group,*.P<0.05.

2.2螺內酯可抑制壓力超負荷誘導的大鼠左心室膠原蛋白沉積 van Gieson染色結果顯示，模型組大鼠心室血管周圍間質內可見明顯的膠原蛋白沉積，而用螺內酯處理可明顯降低膠原蛋白的沉積(圖2A)。定量結果描述為膠原蛋白含量與總蛋白含量的比值，如圖2B顯示，與對照組相比(5.21±0.34 μg/mg protein)，模型組大鼠心室總膠原蛋白相對表達量顯著上調了46.45%(7.63±0.71 μg/mg protein)。而螺內酯組(5.68±0.45 μg/mg protein)顯著低于模型組，且與對照組比較差異無統計學意義。

2.3螺內酯可下調壓力超負荷誘導的大鼠促肥大生長因子的表達 采用ELISA法檢測大鼠左心室促肥大因子血小板源生長因子BB(PDGF-BB)和轉化生長因子β1(TGF-β1)的表達，如圖3所示，與對照組相比(2.21±0.18 pg/mg protein)， 模型組大鼠的PDGF-BB表達量顯著上調了70.14%(3.76±0.32 pg/mg protein)，螺內酯組(2.54±0.22 pg/mg protein)顯著低于模型組，且與對照組差異無統計學意義。與對照組相比(3.14±0.28 pg/mg protein)，模型組大鼠的TGF-β1表達量顯著上調了118.47%(6.86±0.60 pg/mg protein)。然而，螺內酯組(4.02±0.35 pg/mg protein)顯著低于模型組，且與對照組比較差異無統計學意義。

圖2 螺內酯對大鼠左心室膠原蛋白沉積的影響Fig.2 Effect of spironolactone on left ventricular collagen deposition in ratsNote: A.Van Gieson staining legend;B.Quantitative analysis of total ventricular collagen in rats;compared with control group,*.P<0.05.

圖3 螺內酯對大鼠心室組織PDGF-BB (A)和TGF-β1 (B)表達的影響Fig.3 Effect of spironolactone on expression of PDGF-BB (A) and TGF-β1(B) in rat ventricular tissueNote: Compared with the control group,*.P<0.05.

2.4螺內酯可抑制壓力超負荷誘導的大鼠c-Raf/ERK1/2信號通路的活化 采用Western blot檢測大鼠左心室組織中c-Raf和ERK1/2的活化情況，研究如圖4所示，與對照組相比，模型組大鼠的c-Raf和ERK1/2磷酸化水平分別顯著上調了106.25%和74.00%，而螺內酯組顯著低于模型組，且與對照組比較差異無統計學意義。

2.5螺內酯可抑制壓力超負荷誘導的大鼠促增殖和促肥大轉錄因子的表達 采用RT-qPCR檢測大鼠左心室組織中促增殖核轉錄因子c-myc和促肥大轉錄因子GATA4的表達情況，如圖5A、B所示，與對照組相比，模型組大鼠的c-myc和GATA4 mRNA表達水平分別顯著上調了115.01%和254.00%，而螺內酯處理可抑制c-myc和GATA4 mRNA的上調，顯著低于模型組，且與對照組比較差異無統計學意義。此外，心房利鈉肽(ANP)基因是一種促肥大基因，其轉錄受GATA4直接調控。圖5C顯示，與對照組相比，模型組大鼠的ANP mRNA表達水平顯著上調了421.00%，而螺內酯處理可抑制ANP mRNA的上調，顯著低于模型組，且與對照組比較差異無統計學意義。

圖4 螺內酯對大鼠心室組織c-Raf和ERK1/2磷酸化的影響Fig.4 Effect of spironolactone on c-Raf and ERK1/2 ph-osphorylation in rat ventricular tissueNote: A and B.Quantitative analysis of c-Raf phosphorylation and protein bands; C and D.Quantitative analysis of ERK1/2 phosphorylation and protein bands;compared with the control group,*.P<0.05.

圖5 螺內酯對大鼠心室組織c-myc (A)、GATA4 (B)、ANP (C) mRNA表達的影響Fig.5 Effect of spironolactone on expression of c-myc (A),GATA4 (B) and ANP (C) mRNA in rat ventricular tissueNote: Compared with the control group,*.P<0.05.

3 討論

醛固酮是一種可引起心肌肥厚的類固醇類激素，為腎素-血管緊張素系統的一部分。螺內酯是一種醛固酮受體拮抗劑，多項研究均證實螺內酯可用于治療慢性心力衰竭、抑制快速心房起搏所致電重構、調節心肌膠原重建等作用，最近動物實驗模型研究表明，螺內酯可預防由于異丙腎上腺素引起的心肌肥厚[17-19]。本研究采用腹主動脈縮窄法建立壓力超負荷誘導的左心室肥厚大鼠模型，然后探討了螺內酯對大鼠左心室重量與體重比值(VW/BW)的影響，研究發現模型組大鼠的VW/BW顯著增加，而螺內酯可顯著降低大鼠的VW/BW。說明螺內酯可有效抑制壓力超負荷誘導的左心室肥厚。由于心室膠原蛋白沉積是心室肥厚的主要病理基礎，本研究結果顯示螺內酯處理可有效降低大鼠心室血管周圍間質的膠原蛋白沉積，從而防止左心室肥厚。

前人研究顯示，壓力超負荷可導致心臟組織中配體的局部釋放，包括生長因子PDGF和TGF-β[4]。PDGF-BB和TGF-β1均是促肥大生長因子，參與機體的炎癥反應，并且PDGF-BB和TGF-β1的上調可促進間質膠原沉積，進而導致心肌肥大。本研究發現，模型組大鼠的PDGF-BB和TGF-β1表達量顯著上調，而螺內酯處理可顯著抑制PDGF-BB和TGF-β1的上調，從而阻斷心室肥大的發病過程。

多種信號轉導通路均涉及心肌細胞肥大的病理過程，c-Raf/ERK1/2信號通路在壓力超負荷誘導的大鼠左心室肥厚中具有關鍵調節作用[9]。在人類中，c-Raf的突變與遺傳性疾病如Noonan綜合征中的心臟肥大有關，這表明c-Raf在心臟肥大的病理生理調節中具有重要作用[12]。ERK1/2是c-Raf的下游分子，在調節導致心肌肥厚的基因表達中發揮關鍵作用[22]。本研究發現，模型組大鼠的c-Raf和ERK1/2磷酸化水平分別顯著上調了106.25%和74.00%，而螺內酯可明顯抑制c-Raf和ERK1/2的活化。

ERK1/2的磷酸化與心臟轉錄因子c-myc和GATA4的上調有關[9,23,24]。ERK1/2的磷酸化可誘導c-myc的高表達，從而促進細胞增殖、纖維化和膠原沉積[22]。c-Raf/ERK1/2通路的激活也可誘導心肌細胞肥大中的心臟轉錄因子GATA4的高表達[9]。本研究結果與其他報道一致，c-Raf/ERK1/2信號通路的磷酸化和活化伴隨著促增殖核轉錄因子c-myc的上調，以及促肥大轉錄因子GATA4的上調，這些因子與細胞增殖和纖維化有關[25]。此外，GATA4可控制促肥大基因ANP的轉錄[26]，本研究中也發現了ANP在模型組大鼠中顯著上調。然而，螺內酯處理則可顯著抑制c-myc、GATA4和ANP的表達。

綜上所述，本研究表明螺內酯可有效抑制壓力超負荷誘導的大鼠左心室肥厚。主要是由于螺內酯抑制了促肥大生長因子(PDGF-BB和TGF-β1)的表達，減弱了膠原蛋白沉積。此外，螺內酯可通過抑制c-Raf/ERK1/2信號通路的活化來阻斷促肥大相關因子的表達，并降低炎癥反應，從而預防左心室肥厚。