川芎嗪對腎透明細胞癌增殖和侵襲作用及其機制的研究①

曹艷華 薛 霞 李 娟 曹佩華 欒 云

(山東大學第二醫院藥學部,濟南250033)

腎透明細胞癌(Renal clear cell carcinoma,RCC)簡稱腎癌，是起源于腎實質泌尿小管上皮系統的惡性腫瘤，是泌尿系統最為常見的惡性腫瘤之一，在泌尿生殖系統惡性腫瘤中占第二位，在腎癌發病患者中大約有25%的腎癌患者發展成為晚期腎癌或者轉移腎癌[1,2]。隨著現代人生活飲食方式的改變，RCC的發病率越來越高，也越來越年輕化[3]。但其發病原因尚不明確，主要與內在基因和環境因素有關。目前，RCC缺乏早期的診斷標志，晚期的和轉移的RCC常對化療藥物(如吉西他濱、長春新堿、5-氟尿嘧啶等)和激素不太敏感，同時對細胞因子如干擾素α、IL-2等的治療有效率也偏低，且長期使用的副作用較大，因此，目前的治療手段很難為進展期行手術治療后的患者提供持續有效的后期治療，迫切需要對傳統的治療方法進行革新[4]。據統計，有局部侵襲的腎透明細胞癌患者行腎癌根治術后復發率高達35%～65%[5]。因此，尋找新的方法來提高患者的生存率、無復發生存率以及生活質量十分有意義。

傘形科植物川芎是我國的傳統中草藥，具有良好的活血化瘀功效，在我國應用歷史悠久，其提取單體川芎嗪(Tetramethylpyrazine,TMP)是它的主要有效成分之一[6]。川芎嗪是一種生物堿，無色針狀結晶，熔點80～82℃(顯微測定)，沸點190℃。具有異臭，有吸濕性，易升華，易溶于二甲基亞砜、石油醚，溶于氯仿、稀鹽酸，微溶于乙醚，不溶于冷水。具有明確的化學結構，為四甲基吡嗪，自1957年被分離提純以來，其人工合成工藝已日臻成熟。目前，該藥已廣泛應用到多種疾病的治療和預防之中[7,8]。近年來，川芎嗪的抗腫瘤作用在許多研究中得到了證實，越來越多的學者開始關注該藥在抗癌方面的作用。

上皮間充質轉化(Epithelial mesenchymal transformation，EMT)在腫瘤的侵襲和轉移過程中扮演了重要角色，腫瘤細胞EMT的程度直接決定了腫瘤的惡性程度[9]。 EMT發生時伴有顯著的形態學改變，表現為上皮樣細胞少而間質細胞增多。 EMT最顯著的特征是上皮標志物N-cadherin間質細胞標志蛋白和有關的轉錄因子表達上調[10]。 EMT可通過不同的信號通路如Notch、 Wnt 等通路激活，這些分子通路受到細胞內轉錄因子 Snail 和 Slug 的調控來誘導EMT的發生[11]。

因此，本研究采用RCC細胞系A498，主要探討川芎嗪是否通過促進EMT相關蛋白表達從而影響RCC惡性生物行為。

1 材料與方法

1.1材料 川芎嗪單體購自中國食品藥品檢定研究院；腎透明細胞癌A498細胞購自中科院上海細胞庫；6周齡雄性裸鼠由山東大學動物實驗中心提供；蛋白定量試劑盒、SDS凝膠試劑盒、二甲基亞砜(DMSO)細胞裂解液、結晶紫、高錳酸鉀、草酸、冰醋酸和磷鎢酸均購自西安科昊生物有限公司；蛋白酶抑制劑購自羅氏試劑生物有限公司；高糖DMEM培養基、優級胎牛血清、胰蛋白酶消化液均購自美國 HyClone；青鏈霉素混合液、4%多聚甲醛、天狼星紅染液、苯胺藍和蘇木素均購自北京碧云天有限公司，Actin、N-cadherin、Snail和Slug抗體、兔二抗購自英國 Abcam；ECL化學發光試劑盒購自美國 Advansta；Transwell小室購自康寧。

1.2方法

1.2.1MTT增殖實驗 川芎嗪單體先用DMSO溶解再用PBS溶解為20 mg/ml的母液，pH=7.4。A498細胞計數4×105鋪板，培養條件 5%CO2，37℃孵箱分別培養24、48和72 h。隨后每孔加入20 μl的MTT，孵箱放置4 h后吸取培養液，每孔加入150 μl 二甲基亞砜，振蕩15 min。酶標儀570 nm 測吸光值。

1.2.2克隆形成實驗 對數生長期A498細胞，胰蛋白酶消化計數，6孔板，每孔300個細胞，2 ml培養液，培養15 d后，PBS沖洗，室溫風干，結晶紫染色，計數。

1.2.3Transwell遷移實驗 胰蛋白酶消化對數生長期A498細胞，無血清的DMEM培養液調整細胞密度至5×104，Transwell下室加入含10%胎牛血清DMEM培養液600 μl，上室加入200 μl無血清DMEM細胞懸液。鋪板12 h后PBS沖洗2次，4%多聚甲醛固定15 min，放置室溫自然風干。隨后結晶紫染色10 min，PBS沖洗3次，棉簽輕輕擦去上層未遷移的細胞，33%乙酸脫色，酶標儀570 nm讀值。

1.2.4Transwell侵襲實驗 胰蛋白酶消化對數生長期A498細胞，無血清的DMEM培養液調整細胞密度至5×104，Transwell下室加入含10%胎牛血清DMEM培養液600 μl，上室先鋪水化的BD膠基底膜，再加200 μl無血清細胞懸液。鋪板24 h后PBS沖洗2次，4%多聚甲醛固定15 min，放置室溫自然風干。隨后結晶紫染色10 min，PBS沖洗3次，棉簽輕輕擦去上層未遷移的細胞，33%乙酸脫色，酶標儀570 nm讀值。

1.2.5裸鼠皮下荷瘤模型 裸鼠隨機分為陰性對照組和川芎嗪給藥組各7只，對數生長期的A498細胞，調整至5×106個/200 μl，將細胞在無血清DMEM培養液中混勻，分別接種至兩組裸鼠，給藥組，川芎嗪5 mg/kg每3 d腹腔給藥1次。裸鼠7 d后皮下成瘤，游標卡尺測腫瘤大小，每2 d測1次，長徑(a)和短徑(b)，計算腫瘤體積：公式(V) =ab2/2。

1.2.6Western blot 調整A549細胞數4×105個/孔，直接鋪板接種6孔板，培養箱設定37℃、5%CO2進行培養，80%細胞密度時收集細胞，PBS洗滌1 min后加含有蛋白酶抑制劑的裂解液放置冰上裂解，30 min 后高速離心吸抽蛋白。蛋白定量完成后加上樣緩沖液，沸水煮5 min。SDS-PACE電泳后進行轉膜操作，轉膜成功后用脫脂牛奶進行封閉，PBST清洗，均為1∶1 000稀釋一抗，室溫孵育1 h后4℃過夜。次日反復清洗條帶，加二抗室溫孵育90 min，PBS反復沖洗，發光拍照。

2 結果

2.1不同濃度川芎嗪處理后抑制A498細胞增殖能力 不同濃度的川芎嗪作用 A498 細胞 24、48、72 h 后，MTT 比色法測得的各組OD570值。統計學分析，各處理組(≥0.2 mg/ml)與對照組之間差異有統計學意義(P<0.05)0、0.2、0.4、0.8及1 mg/ml川芎嗪處理組能有效抑制 A498 細胞的增殖，并隨著川芎嗪濃度的增加和作用時間的延長，細胞增殖的抑制率增加(P<0.05)。當川芎嗪的藥物濃度<0.2 mg/ml時，對細胞的抑制作用不明顯(P>0.05)，即使時間延長未見明顯的抑制作用。以川芎嗪作用24 h細胞的存活率分別為 98.7±8.8、93.6±6.4、90.2±5.1、82.3±4.6、63.6±5.3;作用48 h的細胞存活率為 95.6±8.7、90.2±6.2、82.3±5.7、73.6±6.2、52.9±4.4；作用72 h的細胞抑制率為94.3±7.1、86.6±6.3、72.3±5.7、61.2±6.4、40.6±3.8。川芎嗪作用24 h的IC50約為1.24 mg/ml，48 h的IC50約為0.1.05 mg/ml，72 h的IC50約0.95 mg/ml。川芎嗪對A498細胞增殖的抑制用在一定的濃度(≥0.2 mg/ml)和時間范圍內，表現出時效與量效關系。見圖1。

2.2不同濃度川芎嗪處理后抑制A498細胞克隆形成能力 分別以0、0.2、0.4、0.8及1 mg/ml川芎嗪處理A498 細胞，與0 mg/ml相比，其余各組均抑制了A498，且隨著藥物濃度的增加，抑制作用越明顯(P<0.05)， 見圖2。

2.3不同濃度川芎嗪處理后抑制A498細胞遷移能力 分別以0、0.2、0.4、0.8及1 mg/ml川芎嗪處理A498 細胞，與0 mg/ml相比，其余各組均抑制了A498的遷移能力，且隨著藥物濃度的增加，抑制作用顯著增加(P<0.05)，見圖3。

2.4不同濃度川芎嗪處理后抑制A498細胞侵襲能力 分別以0、0.2、0.4、0.8及1 mg/ml川芎嗪處理A498 細胞，與0 mg/ml相比，其余各組均抑制了A498細胞的侵襲能力，且隨著藥物濃度越大，侵襲能力抑制作用越明顯(P<0.05)，見圖4。

2.5川芎嗪抑制了腎透明細胞癌在裸鼠體內的增殖能力 以5 mg/kg川芎嗪給藥處理，27 d后處死小鼠，測腫瘤大小并繪制腫瘤成長曲線，結果顯示川芎嗪處理組顯著抑制裸鼠皮下成瘤及移植瘤的生長。從腫瘤生長曲線可以看出川芎嗪給藥處理后腫瘤生長明顯被抑制，且腫瘤體積較對照組顯著減小，差異具有統計學意義(P<0.05)，見圖5。

圖1 不同濃度的川芎嗪作用不同時間對 A498 細胞增殖的影響Fig.1 Effects of different concentrations of ligustrazine on proliferation of A498 cells at different timeNote: *.P<0.05，**.P<0.01，***.P<0.001.

圖2 不同濃度川芎嗪處理后A498細胞克隆形成能力Fig.2 Cloning ability of A498 cells after treatment with different concentrations of tetramethylpyrazineNote: *.P<0.05，***.P<0.001.

圖4 不同濃度川芎嗪處理后A498細胞侵襲能力影響Fig.4 Effects of different concentrations of ligustrazine on invasive ability of A498 cellsNote: *.P<0.05，***.P<0.001.

圖5 川芎嗪對腎透明細胞癌在裸鼠體內的增殖能力影響Fig.5 Effect of ligustrazine on proliferation of renal clear cell carcinoma in nude mice

圖6 不同濃度川芎嗪處理后A498細胞EMT標志蛋白N-cadherin、Snail和Slug表達的影響Fig.6 Effects of different concentrations of ligustrazine on expression of EMT marker proteins N-cadherin,Snail and Slug in A498 cells

2.6川芎嗪抑制了腎透明細胞癌EMT機制 川芎嗪對A498細胞中EMT標志蛋白N-cadherin、Snail和Slug表達的影響，由Western blot結果可知,隨著濃度和時間的增加，川芎嗪抑制了N-cadherin、Snail和Slug的表達(P<0.05)，見圖6。

3 討論

川芎為傘形科植物川芎的干燥根莖，具有活血行氣、祛風止痛、行氣開郁等諸多功效。川芎嗪是從川芎根莖中分離的藥理活性成分之一，長期以來被廣泛應用于預防和治療缺血性腦中風和心血管疾病。除了在傳統領域的應用外，川芎嗪一些新的藥理活性陸續被發現，如對抗自由基，改善微循環以及抗腫瘤作用[24]。現有研究表明川芎嗪對肺間質纖維化、術后腸黏連性的腸梗阻、過敏性紫癜等疾病均有療效。此外，川芎嗪在腫瘤的預防和治療方面的作用也日益得到重視。其中有文獻報道TMP能提高NK細胞活性及通過抑制可溶性MICA表達水平避免抑制NK細胞毒性從而起到抑制腫瘤的作用；在體內和體外TMP通過下調NF-κB表達抑制骨肉瘤細胞增殖，通過下調趨化因子受體CXCR4表達保護神經細胞抑制神經膠質瘤，通過調節ERK1/2和p38信號通路從而減少白細胞介素的表達，從而抑制人類卵巢癌的遷移，以及通過多種調節抑制肝癌、乳腺癌的增殖遷移等[25]。研究發現川芎嗪能夠保護血管內皮，能對損傷后的血管內皮細胞的修復起到保護作用。川芎嗪還能對腎功能產生影響，具有明顯的利尿作用，增加腎血流量，提高腎小球的濾過率；對中樞神經系統起到鎮痛鎮靜的作用；減少炎癥反應；對癌癥的某些過程產生抑制作用等[26]。

腎癌導致死亡的主要原因是由于腎癌細胞在體內的增殖形成新的轉移病灶。大多數腎癌患者被發現是多處于晚期，因為腎癌細胞已經在體內轉移增殖，因此腎癌細胞在體內增殖能力的強弱對腫瘤的發生發展顯得尤為重要[12,13]。因為腫瘤的惡性生物學行為主要包括了腫瘤細胞的增殖以及其侵襲能力。細胞基因突變可能是導致腫瘤細胞獲得無限增殖的能力，而腫瘤細胞的增殖能力對腫瘤在體內的增殖生存起到至關重要的作用[14]。本研究通過MTT和克隆形成實驗，檢測了川芎嗪單體對腎透明細胞增殖能力的影響，結果發現0.4 mg/ml川芎嗪處理腎透明細胞癌A498細胞48 h后可以顯著抑制其增殖能力和克隆形成，1 mg/ml作用72 h后抑制作用更加明顯，說明川芎嗪對腎透明細胞癌A498細胞增殖能力具有顯著的抑制作用。細胞遷移和侵襲能力是腫瘤細胞在體內轉移到遠端形成新病灶的主要原因[15]，特別是腫瘤細胞的侵襲能力越強，其對正常組織的侵潤能力越強，大多數腫瘤患者死亡原因都是后期腫瘤在體內擴散轉移形成多處病變最終導致死亡的。因此針對腎透明細胞癌的轉移和侵襲能力研究一直是其治療的研究熱點[16,17]。本研究中，透過Transwell下室遷移和侵襲實驗模擬腫瘤細胞在體內的轉移和侵襲環境，結果發現川芎嗪可以很好地抑制腎透明細胞癌A498細胞的遷移和侵襲能力，為川芎嗪的抑癌作用研究提供了有力的證明。

EMT是腫瘤發生轉移和侵襲最經典分子機制，腫瘤細胞發生EMT的程度直接決定了腫瘤細胞的惡性程度[18]。腫瘤細胞發生EMT時最顯著的特征是間質細胞標志蛋白N-cadherin表達上調[19]。同時腫瘤細胞內Notch/Wnt 等通路信號活化可以激活腫瘤細胞內轉錄因子Snail和Slug來調控誘導 EMT 的發生[20]。N-cadherin作為EMT的標志蛋白在正常組織中表達很低，細胞發生癌變后其表達量增加促進EMT的發生并促使血管再生，增加腫瘤細胞的侵襲和轉移能力[21,22]。Snail是一類具有鋅指結構的轉錄因子其可以與Smad 相互作用促進N-cadherin的表達，從而增加腫瘤細胞的侵襲轉移能力[23]。本研究通過Western blot 檢測了不同濃度川穹嗪處理后A498細胞不同時間后EMT 標志物和調控因子蛋白表達水平的變化，結果川芎嗪同樣顯著抑制N-cadherin、Snail和Slug的表達。

本研究體外細胞實驗表明川芎嗪抑制腎透明細胞癌A498細胞的增殖能力、細胞遷移和侵襲能力，說明川芎嗪可以抑制腎透明細胞癌的轉移和形成遠端病灶的能力。此外，體內動物實驗結果顯示川芎嗪顯著抑制裸鼠皮下成瘤及移植瘤的生長，結果同細胞實驗一致。Western blot結果可知,隨著給藥濃度和時間的增加，川芎嗪抑制了N-cadherin、Snail和Slug的表達，抑制EMT發生從而抑制腎透明細胞癌的增殖、轉移和形成遠端病灶。

綜上所述，本論文首次研究中藥提取物川芎嗪對腎癌細胞A498的增殖、遷移和侵襲能力的體內和體外研究，同時首次探討了川芎嗪對腫瘤發生轉移侵襲經典途徑EMT機制的影響，發現川芎嗪在體內外可以通過抑制EMT發生從而抑制腎癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力。川芎嗪在腎透明細胞癌中最先結合并發揮作用的首觸分子是如何具體影響EMT發生的，有待于進一步的研究探索。