激活TLR5和 NLRC4通路的重組鞭毛素蛋白對4T1乳腺癌細胞及荷瘤小鼠的影響①

張 景 李榮輝 羅 力 卓召振 袁 軍 李 偉

(貴州醫科大學免疫學教研室，貴陽550004)

據世界衛生組織的數據顯示，女性腫瘤中發病率最高的是乳腺癌，而乳腺癌的標化死亡率(Standard mortality ratio，SMR)在所有癌癥中位列第二，緊隨肺癌之后[1]。乳腺癌對人類產生的威脅不容忽視，人類對于乳腺癌的研究還有待深入。Toll 樣受體(Toll-like receptors,TLRs)是一類重要的模式識別受體，表達于多種正常細胞，通過對病原體相關分子模式(Pathogen-associated molecula patterns,PAMPs)等的識別啟動細胞內信號轉導，通過分泌細胞因子等物質從而產生生物學效應，對固有免疫應答和適應性免疫應答均有調節作用[2-5]。其中TLR5 表達于一些固有免疫細胞，鞭毛素蛋白(Flagellin)作為其唯一的配體，能夠被 TLR5 特異性識別，識別后啟動 TLR5 和 NLRC4 信號通路[2]。有文獻報道稱，TLR5 在人乳腺癌中高表達，并且其通路在人乳腺癌細胞中起著重要作用。這種作用主要表現在，激活乳腺癌細胞上的 TLR5 通路后能抑制腫瘤細胞的增殖，從而推斷出以鞭毛素蛋白激活 TLR5通路后，促進促炎癥細胞因子分泌而產生的潛在抗腫瘤效應[6]。另一些研究表明，鞭毛素蛋白對一部分腫瘤細胞，如胃癌細胞，不僅沒有抑制作用，反而有促進腫瘤細胞增殖的作用[7]。但也有研究表明，在小鼠乳腺癌模型中，不同時間段注射鞭毛素蛋白治療腫瘤會起到完全相反的作用，在腫瘤早期使用鞭毛素蛋白會促進腫瘤增長，而腫瘤移植后8～10 d開始注射則可顯著抑制腫瘤，另外，CpG 寡核苷酸能激活 TLR9通路產生抗腫瘤效果，而鞭毛素蛋白與其聯用后，能顯著增強 CpG 寡核苷酸對腫瘤生長的抑制效果[2]。

本課題組在之前的實驗中已證實鞭毛素蛋白對多種乳腺癌細胞具有抑制作用，不激活TLR5或NLRC4通路的鞭毛素蛋白也可以抑制乳腺癌細胞增殖，對于乳腺癌4T1細胞尚無相關報道，本研究將探索激活TLR5和NLRC4通路對乳腺癌4T1細胞增殖及荷瘤小鼠腫瘤生長的影響，為我們進一步了解鞭毛素蛋白在腫瘤免疫中的作用，以及利用鞭毛素蛋白進行抗腫瘤免疫打下實驗基礎。

1 材料與方法

1.1材料 4T1小鼠乳腺癌細胞(北京北納創聯生物技術研究院)，DMEM培養基(Gibco)，RPMI1640培養基(Hyclone)，無菌PBS(博士德公司)，氨芐青霉素和鏈霉素(北京索萊寶公司)，胎牛血清(杭州四季青公司)，0.25%胰蛋白酶(Hyclone)，培養瓶(美國康寧)，EIPTG，EBradford蛋白定量試劑盒，EMTT細胞增殖檢測試劑盒DMSO(北京索萊寶公司)，酶標儀(Thermo)，內毒素檢測試劑盒(廈門鱟試劑有限公司)，人IL-8細胞因子檢測試劑盒，小鼠IL-1β檢測試劑盒(武漢博士德公司)，LDH釋放檢測試劑盒(碧云天)，BALB/c小鼠(重慶騰鑫動物有限公司)，表達菌株FliC，EFliC-L3A、FliCΔ90-97 和 FliCΔ90-97:L3A(中國科學院武漢病毒所鄢慧民研究員惠贈)。

1.2方法

1.2.1細胞培養 4T1、Caco-2細胞培養于含10%胎牛血清的DMEM完全培養基中，每隔3～5 d進行傳代培養，待細胞進入對數生長期時，收獲細胞備用。

1.2.2重組鞭毛素蛋白活性檢測 利用人腸上皮細胞系Caco-2細胞檢測TLR5通路激活，將培養好的Caco-2細胞傳代接種至24孔板，約2×105個/孔，10%FBS高糖DMEM，37℃，5%CO2培養5 d。細胞極化好后換用無血清DMEM培養基進行培養，待細胞饑餓8～12 h后，吸棄培養基，用無血清培養基將純化后鞭毛素蛋白稀釋成10 μg/ml，每組3個重復，刺激6 h發收集上清，檢測IL-8的濃度(詳細步驟參見人IL-8細胞因子檢測試劑盒說明書)。

利用小鼠腹腔原代巨噬細胞檢測NLRC4通路的激活：小鼠摘眼球放血，脫頸椎處死，75%酒精消毒腹部，放入超凈臺中，從胸骨劍突處V型剪開小鼠皮毛，向下撕開鼠皮至盆骨處，暴露整個腹壁，腹腔注射10 ml RPMI1640培養基和適量空氣，雙手緊握小鼠頸部和尾部，劇烈振蕩20次，使腹腔巨噬細胞充分洗脫下來。在劍突下方剪一小口，用巴氏吸管插入腹腔，吸取灌洗液，注意不要有血液污染。灌洗液離心后棄上清后加1 ml 10%FBS的RPMI1640，混勻后細胞計數。調整細胞數量，每孔約5×105個細胞鋪于96孔板。過夜培養后，用 RPMI1640 洗去未貼壁的非巨噬細胞，加入50 μl RPMI1640培養基稀釋后的LPS(50 ng/ml) 預處理3 h，輕輕用PBS清洗一遍。加入200 μl 3%FBS的RPMI1640稀釋后的鞭毛素蛋白(10 μg/ml) 刺激20 h，以上均嚴格無菌操作，實驗結束前1 h陽性對照孔加入1%體積的LDH，收集上清檢測IL-1β和LDH(詳細步驟參見人IL-1β、LDH檢測試劑盒說明書)。

1.2.3MTT檢測細胞增殖 配制鞭毛素蛋白，使其濃度為2 μg/ml，充分渦旋混勻，注意無菌操作,然后相應鞭毛素蛋白孔加入100 μl,充分吹散細胞，混勻，牛鮑氏計數板計數，調整細胞數至4×104個/ml，每孔加100 μl,即每孔細胞數為4 000個,37℃ 5%CO2培養70 h。然后每孔加入10 μl的MTT 試劑,繼續培養 4 h。800 r/min離心5 min,輕輕甩掉上清，加入150 μl DMSO,37℃10 min或室溫搖床10 min 使甲臜充分溶解,測定OD490 nm值，根據公式計算抑制率。抑制率(%)=(空白組OD值-處理組OD值)/空白組OD值×100%。

1.2.4鞭毛素蛋白對荷瘤小鼠的影響 雌性BALB/c 6～8周齡小鼠先觀察3～5 d確認小鼠無異常后開始正式實驗，將30只小鼠隨機分為6組，分別是Control組、生理鹽水(Normal Saline，NS)組、FliC組、FliCΔ90-97組、FliCΔL3A組和FliCΔ90-97：L3A組，Control組小鼠不作任何處理，其余小鼠乳腺部位皮下注射乳腺癌4T1細胞3.5×105個/只，建立乳腺癌腫瘤模型，造模第7天起分別腹腔注射鞭毛素蛋白或生理鹽水，隔天一次，共10次，并記錄小鼠腫瘤大小、體重變化。其中測量腫瘤大小的方法是用游標卡尺分別測量長徑(L)和短徑(D)，并用公式V=L×D2/2 計算腫瘤體積大小。

1.3統計學處理 實驗結果用GraphPad Prism 5軟件進行統計處理。所得結果的比較采用Oneway ANOVA和t檢驗共同分析，以P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1重組鞭毛素蛋白的活性檢測 四種重組鞭毛素蛋白刺激Caco-2細胞系，結果顯示能夠激活TLR5通路的全長FliC組和FliC-L3A組IL-8分泌分別為(540.62±46.05)pg/ml和(357.48±32.32) pg/ml與對照組(32.68±2.49)pg/ml相比有顯著差異(P<0.01)，而不能激活TLR5通路的FliCΔ90-97和FliCΔ90-97:L3A組IL-8分泌與對照組相比無統計學差異(P>0.05)(圖1A)。

四種重組鞭毛素蛋白刺激小鼠腹腔原代巨噬細胞，鞭毛素蛋白激活NLRC4炎癥小體后，不僅可以導致細胞炎癥因子IL-1β和IL-8的分泌，同時還可以誘導細胞的凋亡，這種凋亡是依賴Caspase-1蛋白的，使胞質中的LDH釋放出來。結果顯示，全長FliC和FliCΔ90-97分泌IL-1β分別為(1 656.26±160.71)pg/ml、(1 039.18±151.5)pg/ml，與對照組(62.91±19.17)pg/ml相比差異有統計學意義(P<0.01)。相反FliC-L3A組和FliCΔ90-97:L3A組與對照組相比IL-1β釋放無差異(P>0.05)(圖1B、C)。

2.2MTT法檢測不同濃度重組鞭毛素蛋白對4T1乳腺癌細胞的抑制作用 由圖2可知，四種鞭毛素蛋白在1 μg/ml的濃度下，兩條通路都不激活的FliCΔ90-97對4T1細胞的抑制率達到38.84%,高于全長的FliC(35.53%)、FliC-L3A(36.33%)和FliCΔ90-97：L3A(37.64%)，說明鞭毛素蛋白抑制4T1細胞增殖可能通過其他途徑。經Graphpad 軟件統計學分析， 四種鞭毛素蛋白對4T1細胞的抑制作用與Control組相比差異均有顯著統計學意義(P<0.05)，順鉑作為陽性對照(抑制率為44.87%)。

圖1 四種重組鞭毛素蛋白激活TLR5和NLRC4通路的活性檢測Fig.1 Bioactivity activating TLR5 and NLRC4 pathways of four recombinant flagellinsNote: **.P<0.01.

圖2 重組鞭毛素蛋白抑制4T1細胞的增殖Fig.2 Recombinant flagellins inhibit proliferation of 4T1Note: **.P<0.01.

圖3 小鼠體重變化趨勢 Fig.3 Variation tendency of mice weight

圖4 小鼠腫瘤體積變化Fig.4 Variation tendency of tumor volumeNote: *.P<0.05.

2.3各組小鼠體重變化及總體身體情況 如圖3所示，用天平測量小鼠體重并監測體重變化。注射鞭毛素蛋白(圖3中第7天)前，各組小鼠體重呈上升趨勢，而開始免疫后，各組體重均有不同程度的下降，后續有一定波動，最終，FliC組的平均體重最輕約為17.34 g，FliCΔ90-97：L3A組18.08 g,FliCΔ90-97組18.47 g,FliC-L3A組19.13 g，NS組18.78 g,Control組體重最重為19.75 g。從生活狀態觀察，Control組小鼠飲食及精神狀態正常，鞭毛素蛋白組稍差，NS組自發活動減少，靜臥不動，背毛粗糙。直至實驗第28天，為小鼠處死時間，統一處死小鼠后得到各組最終生存率。 Control組為未接種腫瘤的空白對照組，其最終生存率為 100%,實驗過程中沒有小鼠死亡，其次是鞭毛素蛋白組,其最終生存率為60%，NS組最終生存率為 20%(數據沒有展示)。

2.4各組小鼠腫瘤生長情況 如圖4所示，與NS組相比,19 d后，FliC組、FliCΔ90-97:L3A組和FliC-L3A組對腫瘤生長均有顯著抑制作用(P<0.05)。但是，FliCΔ90-97組卻沒有明顯的抑制腫瘤生長的作用(P>0.05)。FliC-L3A、 FliCΔ90-97:L3A和FliC三組對腫瘤的抑制沒有顯著差異(P>0.05)。

3 討論

鞭毛素蛋白的相關研究主要基于其佐劑功能和抗腫瘤作用，近年來可以被胞內NLRC4識別的分子機制被逐漸闡明。鞭毛素蛋白可以通過激活乳腺癌細胞上的TLR5抑制腫瘤細胞的增殖[8]，NLRC4炎癥小體在結腸癌的發生發展中起重要作用[9]，另外鞭毛素蛋白能夠增強腫瘤的放療敏感性[10]，雖然鞭毛素蛋白對某些腫瘤細胞有直接的抑制作用，如乳腺癌、肺癌等[11,12]，但是腫瘤細胞對于鞭毛素蛋白的反應性不盡相同，這不僅僅和TLR5的亞細胞定位有關，體內實驗表明，鞭毛素蛋白和腫瘤細胞同時注射產生的效應與鞭毛素蛋白在腫瘤細胞之后注射產生的效應相反，可能與激活TLR5和NLRC4導致的細胞因子分泌情況的差異，誘導出不一樣的免疫應答有關[13,14]。提示鞭毛素蛋白可以通過激活TLR5和(或)NLRC4兩條信號通路發揮抗腫瘤的作用。我們實驗室前期的工作發現鞭毛素蛋白能夠激活人乳腺癌細胞系MCF-7的TLR5通路，并分泌IL-8等細胞因子[13]。

4T1細胞系是構建小鼠乳腺癌動物模型常用的細胞系。通過體外研究重組鞭毛素蛋白對4T1細胞系的影響，可以為我們利用小鼠乳腺癌模型研究TLR5和NLRC4兩條通路在腫瘤免疫中的影響打下基礎。本實驗表明，重組鞭毛素蛋白體外對乳腺癌4T1細胞有抑制作用，我們課題組前期也發現重組鞭毛素蛋白對乳腺癌細胞系MCF-7細胞和MDA-231細胞均有顯著的抑制作用[15]。這說明重組鞭毛素蛋白對人乳腺癌細胞系和小鼠乳腺癌細胞系均有顯著的抑制作用，而且這種抑制作用與TLR5和NLRC4通路的激活無顯著相關性。

動物實驗中各鞭毛素蛋白對乳腺癌的抑制作用與體外實驗結果并不完全一致，由于體外實驗結果顯示各組鞭毛素蛋白抑制乳腺癌細胞系4T1的能力無顯著差異，所以動物實驗結果顯示各組間的差異可能與體內TLR5和NLRC4通路的激活密切相關。當只激活NLRC4通路，鞭毛素蛋白不能抑制腫瘤的增殖。說明體內NLRC4通路的激活減弱了鞭毛素蛋白抑制腫瘤增殖的能力。只激活TLR5通路和同時激活TLR5和NLRC4通路都不能顯著增強FliCΔ90-97:L3A蛋白抑制腫瘤增殖的能力，說明體內TLR5通路的激活并不能夠增強機體的抗腫瘤免疫細胞的殺傷腫瘤的能力。先前我們認為重組鞭毛素蛋白對腫瘤的抑制作用有直接作用和間接作用之分，可以通過對腫瘤細胞的直接作用影響腫瘤細胞的生長，也可通過對免疫系統的間接作用促進免疫系統對腫瘤的殺傷，從而抑制腫瘤生長。但是本實驗結果顯示，鞭毛素蛋白激活荷瘤小鼠體內的TLR5和NLRC4兩條通路對乳腺癌細胞增殖有不同的影響。FliCΔ90-97組腫瘤體積與NS組相當，說明在體內單獨激活NLRC4通路并不能有效抑制乳腺癌腫瘤的生長，其原因還需進一步研究。因此，我們在利用鞭毛素蛋白抗腫瘤的同時，應盡量避免其激活體內的NLRC4通路。鞭毛素蛋白作用后小鼠的存活率與NS組相比明顯增高，說明鞭毛素蛋白能提高荷瘤小鼠的存活率(數據未展示)。本實驗結果為我們進一步了解鞭毛素蛋白在腫瘤免疫中的作用，以及利用鞭毛素蛋白進行抗腫瘤免疫打下實驗基礎。