CD4+CD25+調節性T細胞在HBV感染相關性血小板減少患者外周血中的比例和意義①

蔣端鳳 莫秋玉 林文遠 張國珍 周 琴 陶利英 何玉嬋 董 敏

(桂林醫學院附屬醫院血液科，桂林541001)

乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)是一種可引起肝細胞破壞的嗜肝DNA病毒。乙型病毒肝炎是一種全球性傳染性疾病，我國乙肝表面抗原攜帶率高達7.18%，廣西是乙肝高發地區，發病率呈逐年增高趨勢[1]。免疫性血小板減少癥(Immune thrombocytopenia，ITP)，是一種常見自身免疫性出血性疾病，成人年發病率為5/10萬～10/10萬，60歲以上老年人是該病的高發群體[2]。CD4+CD25+調節性T細胞是1995年由Sakaguchi等[3]首次報道的一類特殊的T細胞亞群，具有免疫抑制性和免疫無反應性，在維持自身耐受、免疫穩態和抑制抗腫瘤免疫反應中發揮重要作用[4]。研究顯示，HBV感染與血小板減少存在相關性，除外ITP本身疾病因素、脾功能亢進、TPO水平降低等引起血小板減少原因外，乙肝病毒感染可能是血小板減少的原因之一[5，6]。乙肝病毒感染相關性血小板減少是指伴HBV感染的ITP，是臨床常見血小板減少疾病之一[7]。目前HBV感染相關性血小板減少相關的發病機制尚不明確，國內外相關研究較少。本研究通過檢測HBV感染相關性血小板減少患者、HBV感染患者、ITP患者及健康體檢者外周血中CD4+CD25+調節性T細胞比例，探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1資料

1.1.1臨床資料 桂林醫學院附屬醫院2016年11月至2017年11月住院及門診患者34例，體檢中心健康體檢者10例。檢測HBV表面抗原陰性的10例體檢者為正常對照組；參考肝炎病毒相關性血小板減少癥診斷標準[8]，納入HBV感染相關性血小板減少患者12例為實驗組；參考ITP診斷標準[2]，且HBV表面抗原及HBV DNA定量檢測均為陰性，納入ITP患者12例為ITP組；納入的慢性乙型肝炎患者10例為HBV感染組，滿足以下條件：符合慢性乙型肝炎診斷標準[9]，未抗病毒治療，血常規基本正常，無門脈高壓、肝硬化、脾大等脾功能亢進的證據。各組臨床資料見表1。

1.1.2主要試劑和儀器 FITC標記的鼠抗人CD4單抗、APC標記的鼠抗人CD25單抗及BD FACSTM Lysing Solution(10×)均購自BD Biosciences公司；淋巴細胞分離液購自天津灝洋生物公司；FACS Calibur流式細胞儀為Becton Dickinson公司。

1.2方法

1.2.1外周血單個核細胞分離 所有研究對象用EDTA抗凝管抽取靜脈血2.0 ml，加入PBS液2.0 ml稀釋后，用淋巴分離液常規分離獲得單個核細胞，加入FACSTM Lysing Solution(10×)懸浮細胞，使細胞濃度調整為1.0×107ml-1。

1.2.2細胞免疫熒光染色 取上述懸浮細胞100 μl，分別加入CD4-FITC、CD25-APC各20 μl，混勻后室溫避光孵育15 min；加入PBS液500 μl混勻，1 500 r/min，離心5 min，棄上清。加入0.5 ml PBS充分混勻，懸浮細胞，4 h內流式細胞儀上機檢測。

1.2.3流式細胞檢測 流式細胞儀上機檢測，結果分析應用CellQuest軟件，在FSC-SSC散點圖上選定淋巴細胞群，在FSC-SSC散點圖上選定淋巴細胞群，在淋巴細胞群中以CD4設門選擇CD4陽性細胞分析，得出CD4+T淋巴細胞占淋巴細胞百分比。在淋巴細胞群中以CD25設門選擇CD25陽性細胞分析，得出CD4+CD25+T淋巴細胞占淋巴細胞百分比。在CD4陽性T淋巴細胞群中，以CD25設門選擇CD25陽性細胞分析，得出CD4+CD25+占CD4+T淋巴細胞百分比。

2 結果

2.1實驗組與HBV感染組CD4+、CD4+CD25+及CD4+CD25+/CD4+百分比的比較 實驗組外周血CD4+CD25+百分比較HBV感染組降低[(4.05±3.70)%比(5.36±1.64)%，P=0.048<0.05]，CD4+百分比也降低[(24.64±9.80)%比(38.42±7.70)%，P=0.004<0.05]，見表2。兩組CD4+、CD4+CD25+細胞比例流式檢測結果，見圖1。

2.2實驗組與ITP組、正常對照組CD4+、CD4+CD25+及CD4+CD25+/CD4+百分比的比較 實驗組的上述指標較ITP組、正常對照組，差異均無統計學意義(P>0.05)，具體見表3。

2.3HBV感染組、 ITP組與正常對照組CD4+、CD4+

表1 各組患者的臨床資料

Tab.1 Clinical characteristics of patients in each group

GroupsFemale/male(n)Age(year)HBV DNA(log10 U/ml)Platelet count(×109 L-1)Normal control group(n=10)7/337.6±15.40228±55.0HBV infection group(n=10)3/748.9±10.73.79±2.34212±54.5ITP group(n=12)11/148.2±21.7032.6±28.5Experimental group(n=12)3/954.6±15.02.94±2.5158.6±26.7

圖1 實驗組、HBV感染組CD4+、CD4+CD25+細胞比例流式檢測結果Fig.1 Results of flow cytometry for CD4+ and CD4+CD25+ cells in experimental group and HBV inf-ection group

表2 實驗組與HBV感染組CD4+、CD4+CD25+及CD4+CD25+/CD4+的比較

Tab.2 Comparison of CD4+，CD4+CD25+and CD4+CD25+/CD4+between experimental group and HBV infection group

GroupsnCD4+(%)CD4+CD25+(%)CD4+CD25+/CD4+(%)Experimental group1224.64±9.804.05±3.7014.97±12.0HBV infection group1038.42±7.705.36±1.6414.36±4.70U16.030.047.5P0.0040.0480.410

表3 實驗組與ITP組、正常對照組CD4+、CD4+CD25+及CD4+CD25+/CD4+的比較

Tab.3 Comparison of CD4+,CD4+CD25+and CD4+CD25+/CD4+in ITP group，HBV infection group and normal control group

GroupsnCD4+(%)CD4+CD25+(%)CD4+CD25+/CD4+(%)Experimental group1224.64±9.801)4.05±3.701)14.97±12.0ITP group1231.87±12.73.69±2.911.52±6.6Normal control group1031.72±6.63.61±1.211.27±2.8P10.0730.9080.908P20.0750.5750.742

Note:P1.Experimental group vs ITP group；P2.Experimental group vs normal control group.

圖2 Treg細胞比例與HBV DNA水平的相關性Fig.2 Correlation between Treg cell proportion and HBV DNA levelNote: r=0.167，P=0.603.

圖3 Treg細胞比例與血小板計數的相關性Fig.3 Correlation between proportion of Treg cells and platelet countNote: r=-0.511，P=0.089.

CD25+及CD4+CD25+/CD4+百分比的比較 HBV感染組CD4+CD25+百分比較正常對照組增高[(5.36±1.64)%比(3.61±1.20) %，U=20.0，P=0.023<0.05]，CD4+及CD4+CD25+/CD4+百分比與對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)；ITP組上述指標與對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)。

2.4相關性分析 在置信區間(雙側)，HBV感染相關性血小板減少患者的Treg細胞比例與HBV DNA水平無明顯相關性(r=0.167，P=0.603)，Treg細胞比例與血小板計數存在負相關關系，但差異無統計學意義(r=-0.511，P=0.089)，見圖2、3。分析HBV感染患者的Treg細胞比例與HBV DNA水平無明顯相關性(r=-0.286，P=0.424)，ITP患者的Treg細胞比例與血小板計數無明顯相關性(r=-0.273，P=0.391)。

3 討論

CD4+CD25+調節性T細胞(Tregs)是免疫系統中的重要組成部分，在正常人群外周中表達率為5%至10%[10]。研究表明Tregs在HBV感染后及慢性乙型肝炎(CHB)患者病程進展中扮演重要角色[11]。CHB患者外周血Tregs水平較正常人明顯升高，并同時出現CD4+T、CD8+T細胞數量減少和功能不足，表明Tregs可能通過抑制CD4+和CD8+T細胞的活化和增殖使機體對HBV免疫耐受，引起HBV感染的慢性化[12，13]。研究發現ITP與外周血Tregs缺乏有關，其數量減少和/或功能缺陷與自身免疫性疾病的免疫平衡紊亂和疾病的發生發展密切相關[14，15]。乙肝病毒感染相關性血小板減少癥是臨床常見病之一，其臨床特點既有HBV感染，又符合ITP的診斷，然而發病機制尚不明確。

本研究首次檢測了HBV感染相關性血小板減少患者、HBV感染患者、ITP患者及健康對照者的外周血中CD4+CD25+調節性T細胞比例。結果顯示，外周血CD4+CD25+T細胞比例在實驗組低于HBV感染組，提示HBV感染患者在合并ITP后，CD4+CD25+表達出現下調，與文獻ITP發病時Tregs表達降低相符[16]。CD4+CD25+T細胞比例在實驗組與正常對照組無明顯差異，提示ITP在合并HBV感染后，CD4+CD25+表達出現上調；HBV感染組高于正常對照組，與文獻CHB患者Tregs表達升高相符[17]。綜上，CD4+CD25+調節性T細胞表達可能受乙肝病毒感染相關免疫耐受與ITP相關免疫調節異常共同的影響。此外，CD4表達率僅在實驗組與HBV感染發現差異，可能與各組未以HBV載量比較分析有關[18]。相關性分析結果顯示HBV感染相關性血小板減少患者Tregs比例與血小板計數存在負相關關系(r絕對值>0.5)，但無統計學意義(P>0.05)，擴大病例數分析可能會得到有意義的相關性結果。

對于HBV感染相關性血小板減少患者的治療仍存在許多問題，常遇到血液病醫生建議給予抗乙肝病毒治療，而肝病醫生認為未達到指南推薦的抗乙肝病毒治療指征[9]，會增加費用和停藥風險，不應抗病毒治療。研究表明，抗乙肝病毒治療后CHB患者外周血Tregs表達水平較治療前明顯下降[19]，ITP患者外周血Tregs表達水平也與治療效果相關[20，21]。通過聯合抗病毒藥物及免疫調節藥物干預Tregs表達水平，調節機體免疫狀態，達到治療目的。本研究希望可以通過檢測外周血Tregs比例為本病的聯合抗病毒治療找到一些依據，結果提示外周血CD4+CD25+T細胞比例減低的本病患者，可能需要聯合抗乙肝病毒治療。但依據并不充分，需要進一步檢測比較HBV感染但未達到抗病毒治療指征患者與本病患者的外周血CD4+CD25+T細胞比例情況，并找出減低的量化標準。

當然本研究也存在一些缺陷，由于符合HBV感染相關性診斷的患者十分少見，研究納入病例數較少。沒有進一步將實驗組和ITP組中血小板減少情況進一步細分為初治和復發難治，對結果可能有一定影響，這也可能解釋本研究中ITP組Treg比例與正常組無明顯差異。此外，Tregs的準確免疫表型還應包括FoxP3、CD127low、CD45RO、CD45RA等[22]，本研究只檢測了具有主要調節表型、最常用的CD4+CD25+T細胞，可能未能完全反映一些體現不同功能的Tregs亞群存在的客觀差異[23]。Tregs相關細胞因子IL-10、TGF-β、IL-2、IL-12等也需要進一步檢測以反映Tregs表達變化及意義[24]。展望未來研究方向，通過進一步增加病例數，檢測更準確免疫表型并代表不同功能的Tregs亞群，找到在ITP、CHB、HBV感染相關性血小板減少不同疾病患者中有差異的Tregs亞群，或者能準確反映疾病免疫狀態的Tregs相關細胞因子，希望通過檢測它們在外周血的量的變化，作為評估疾病病情、療效及判斷預后的指標之一。