槲皮素對慢性阻塞性肺疾病大鼠的保護作用①

魏 萍 陳志斌 王春娥 李大治 陳可強

(福建中醫藥大學，福州350102)

慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是典型的阻塞性肺疾病，COPD會常伴有呼吸問題和氣流阻塞，主要表現為呼吸短促、咳痰現象[1,2]。吸煙、空氣污染和揚塵是造成COPD的主要原因[3]。作為一種重要的公眾健康問題，COPD已經成為中國第三大死亡原因[4]。流行統計學數據顯示，2015年中國COPD患病率為8.6%，約有999萬患者患有COPD[5,6]。雖然西藥在COPD的治療中取得了一定治療效果，但是具有為患者帶來極大痛苦的副作用。而中藥在COPD的治療過程中具有療效好，副作用小等特點，越來越受到重視。槲皮素(Quercetin，QT)是一種天然飲食類黃酮，富含于水果、蔬菜、綠茶和一些合成藥物之中，具有較低毒性[7]。近年來，QT廣泛的藥理作用，包括抗氧化、抗炎、抗癌引起大量研究者關注[8]。在COPD發病過程中，IL-6和TNF-α等可通過破壞小氣道和肺泡組織結構與功能導致患者肺功能下降[9,10]。然而QT是否對慢性肺阻塞性肺病有保護作用及分子調控機制尚不清楚。目前主要治療手段為控煙、氧療、支氣管擴張劑和呼吸興奮劑等，雖然臨床療效也有所提高，但是目前高發病率和高死亡率的現狀并無明顯改善[11,12]。積極探索COPD病理機制，對發現有效治療靶點有十分重要的意義。本研究根據前人科研成果，探究QT對大鼠COPD模型的治療效果和作用機制，期望為COPD的治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1試劑 Click-iT?Plus TUNEL assay試劑盒(貨號：C10618)購自Invitrogen公司。蘇木素伊紅(HE)染色試劑盒(貨號：C0105)購自碧云天。Masson Stain Kit Masson染色試劑盒(貨號：60532ES58)購自上海翊圣生物科技有限公司。Caspase-3(貨號：ab13847)、Caspase-9(貨號：ab202068)、TGF-β1(貨號：ab64715)、α-SMA(貨號：ab5694)、GAPDH(貨號：1056)一抗購自美國Abcam公司，HRP標記的山羊抗小鼠二抗購自美國Santa Cruz公司。IL-6(貨號：E-EL-R0015c)、TNF-α(E-EL-R0019)、IL-10(E-EL-R0016)和ELISA試劑盒購自Elabscience。AniRes2005動物肺功能分析系統購自北京貝蘭博科技有限公司。

1.1.2儀器 PCR儀、電泳儀及半干轉膜儀均購自美國伯樂公司。Gel View 6000化學發光凝膠成像系統購自廣州云星儀器有限公司。Multiskan GO酶標儀購自Thermo。

1.2方法

1.2.1應用熏香煙聯合氣道內滴注脂多糖(LPS)的方法造成大鼠COPD模型 經學校實驗動物倫理委員會審查同意后，選擇40只3周齡SPF級別SD大鼠,購自北京維通利華實驗動物公司，許可證號為SCXK (京) 2014-0001。隨機分為四組，分別設置健康對照組(Healthy Ctrl組)、COPD模型組(COPD組)、QT單獨作用組(QT組)和COPD+QT組。大鼠適應性飼養一周后給予香煙聯合氣道內滴注LPS方法進行造模：將各模型組大鼠置于自制有機玻璃熏煙箱中，蓋上蓋子；將黃果樹牌香煙插入點煙盒，然后打開微型真空泵，泵入煙霧。每次點煙20支，熏煙1 h，連續進行3個月。大鼠經氣道內滴注LPS(1 mg/kg)。空白大鼠只進行生理鹽水滴注，不做煙熏處理，建立慢性阻塞性肺疾病大鼠模型后進行相關實驗。用藥治療：口服給藥QT連續四周(50 mg/kg)后，進行相關實驗。

1.2.2大鼠基本指標檢測 QT治療結束后樣本提取前，稱量大鼠體重。檢測大鼠肺功能：大鼠禁食12 h后，用2%戊巴比妥(30 mg/kg)麻醉，將大鼠仰臥固定，剪開頸部皮膚及肌肉進行氣管插管，用AniRes2005動物肺功能分析系統檢測大鼠肺功能。通過一秒用力呼吸氣容積(FEV1)/用力肺活量(FVC)比率對大鼠肺功能進行評價。

1.2.3HE染色 取左肺用生理鹽水充分沖洗，再用10%中性福爾馬林固定，切片經3次二甲苯脫蠟，每次時間分別為15 min、15 min、10 min；梯度酒精脫苯，分別用100%、90%、80%、70%的酒精脫苯10 min；蒸餾水沖洗5 min，2次；蘇木素染核15 min，蒸餾水沖洗；0.5%的鹽酸酒精分色，用蒸餾水沖洗15 min；70%和80%酒精先后浸泡10 min，復染伊紅1 min，90%酒精分化10 s；95%酒精脫水2次，各10 min，100%酒精脫水2次，各15 min，二甲苯透明3次，每次時間分別為10 min、15 min、15 min；中性樹脂封片觀察。

1.2.4ELISA檢測炎癥因子 大鼠心臟取血1 ml，低溫離心機4 000 r/min 8 min，取上清液供實驗使用。加樣：分別設空白孔，標準品待測樣品孔。在酶標包被板上標準品準確加樣50 μl，待測樣品孔先加樣品稀釋液40 μl，然后再加待測樣品10 μl。溫育：用封板膜封板后置于37℃溫育30 min。配液：將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水稀釋30倍后備用。洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30 s后棄去，如此重復5次，拍干。加酶：每孔加入酶標試劑50 μl，空白孔除外。溫育：再次用封板膜封板后置37℃溫育30 min。洗滌：再次小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30 s后棄去，如此重復5次，拍干。顯色：每孔先加入顯色劑A 50 μl，再加入顯色劑B 50 μl輕輕振蕩混勻，37℃避光顯色10 min。終止：每孔加入50 μl終止液，終止反應(此時藍色立轉為黃色)。測定：以空白孔調零，450 nm波長依序測量各孔吸光值(OD值)。測定在加終止液后15 min內進行。

1.2.5TUNEL檢測細胞凋亡 大鼠處死后組織經過石蠟包埋，二甲苯中脫蠟5～10 min，換用新鮮二甲苯，再脫蠟5～10 min。無水乙醇5 min。90%乙醇2 min。70%乙醇2 min，蒸餾水2 min。滴加20 μg/ml 不含DNase的蛋白酶K用P0106免疫染色洗滌液(20～37)℃作用15～30 min。PBS洗滌3次。配制適當量TUNEL檢測液滴加樣品上，37℃避光孵育60 min。洗滌后用抗熒光猝滅封片液封片后顯微鏡下(激發波長范圍為450～500 nm)觀察。

1.2.6Masson染色 切片染色前先用蒸餾水潤濕玻片30～60 s。加入適量蘇木素核染液染色60 s，棄去，清洗液沖洗30 s。加入適量酸性品紅漿染液染色30～60 s，棄去，清洗液沖洗30 s。加入適量磷鉬酸分色液分色6～8 min，棄去。加入適量苯胺藍復染液染色5 min，棄去，用無水乙醇沖洗干凈。吹干后封片鏡檢。

1.2.7Western blot檢測蛋白表達 收集四組肺組織并取相同部位，PBS清洗3次，用添加蛋白酶抑制劑的細胞裂解液裂解提取總蛋白。用BCA試劑盒檢測總蛋白濃度，10% SDS-PAGE分離蛋白后用半干轉膜儀轉移蛋白質至PVDF膜。用5%脫脂牛奶室溫封閉蛋白2 h，隨后加入一抗于4℃封閉過夜，第2天加入對應二抗室溫封閉1 h，最后滴加ECL曝光顯影。顯色并統計灰度值計算相對表達量。

2 結果

2.1QT改善COPD大鼠體重和肺功能指標 QT對大鼠COPD模型治療后，與Healthy Ctrl組相比，QT組大鼠體重和肺功能間無差異；與Healthy Ctrl組比較，COPD組體重和肺功能均顯著下調；與 COPD組比較，COPD+QT組大鼠體重和肺功能均明顯改善(圖1)。

2.2QT抑制COPD肺臟病理損傷 HE染色實驗顯示，與Healthy Ctrl組相比，QT組大鼠支氣管管腔、上皮及肺泡結構完整，管壁未見變厚，黏膜下層未見炎癥性細胞浸潤。提示QT使用對大鼠體征沒有明顯影響；與Healthy Ctrl組比較，COPD組大鼠支氣管管腔嚴重變形，上皮細胞明顯脫落，肺泡腔擴大融合成肺大泡，管壁破壞、增厚，管壁周圍可見大量炎性細胞浸潤；與COPD組比較，COPD+QT組大鼠支氣管管腔形變恢復，上皮細胞脫落改善，管壁厚度逐漸恢復變薄，炎癥浸潤細胞明顯減少，肺泡腔擴大融合現象明顯改善(圖2)。

2.3QT抑制肺泡細胞凋亡及相關因子表達 TUNEL染色實驗顯示，與Healthy Ctrl組比較，QT組肺泡組織中細胞凋亡數目沒有明顯差異；與Healthy Ctrl組比較，COPD組細胞凋亡數目顯著上升；與COPD組比較，COPD+QT組細胞凋亡水平明顯下調(圖3A)。Western blot實驗結果顯示，與Healthy Ctrl組比較，QT組肺泡組織中促凋亡因子Caspase-3和Caspase-9水平差異均無顯著統計學意義；與Healthy Ctrl組比較，COPD組Caspase-3和Caspase-9水平均顯著上升；與COPD組比較，COPD+QT組Caspase-3和Caspase-9水平則顯著下降(圖3B)。

2.4QT降低血清中炎癥因子表達 ELISA檢測血清中相關炎癥因子IL-6、TNF-α和IL-10結果顯示：與Healthy Ctrl組比較，QT組肺泡組織中相關炎癥因子表達水平無差異；與Healthy Ctrl組比較，COPD組炎癥因子IL-6和TNF-α表達水平顯著上升，而抑炎因子IL-10顯著下調；與COPD組比較，COPD+QT組炎癥因子IL-6和TNF-α表達水平顯著下調，抑炎因子IL-10明顯上調(圖4)。

2.5QT降低肺泡組織肺纖維化及凋亡通路分子活性 Masoon染色實驗顯示，與Healthy Ctrl組相比，QT組極少藍色著色于肺泡細胞，大量胞漿被染成紅色；與Healthy Ctrl組比較：COPD組大量具有較深藍色著色于細胞中，很少胞漿紅色減少；與COPD組比較：COPD+QT組肺泡細胞著藍色降低，胞漿著紅色逐漸加深(圖5A)。Western blot檢測肺泡組織中TGF-β1和α-SMA結果顯示：與Healthy Ctrl組比較，QT組TGF-β1和α-SMA表達水平無差異；與Healthy Ctrl組比較，COPD組TGF-β1和α-SMA表達水平顯著上升；與COPD組比較，COPD+QT組TGF-β1和α-SMA表達水平受到顯著下調(圖5B)。

圖1 不同處理組大鼠基本指標測量Fig.1 Basic indexes of rats in different treatment groups were measuredNote: Healthy ctrl.Healthy rats;QT group.Rats received QT;COPD group.Rats treated by the LPS and cigarettes;COPD+QT.Rats treated by the LPS,cigarettes and QT.QT were treated for 4 weeks.**.P<0.01 compared with the control group;##.P<0.01 compared with COPD group.Bars,SEs.

圖2 HE染色鑒定肺泡細胞形態(×200)Fig.2 HE staining detected alveolus pulmonis cells morphology(×200)Note: QT were treated for 4 weeks.

圖3 肺泡組織中凋亡相關因子表達水平Fig.3 Expression of apoptosis-related markers were detected in alveolus pulmonis Note: A.TUNEL；B.Western blot.**.P<0.01 compared with the control group;##.P<0.01 compared with COPD group.Bars,SEs.

圖4 ELISA檢測顯示血清中相關炎癥因子表達水平Fig.4 Expression of inflammatory factors were detected in serum by Note: **.P<0.01 compared with the control group;##.P<0.01 compared with COPD group.Bars,SEs.

3 討論

COPD是一種進展性疾病，最終會演變為每天發作，如行走或增加壓力都會導致呼吸困難[13]，嚴重影響患者生活質量。COPD患者肺內含有多種炎癥細胞，如中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、肺泡巨噬細胞等，炎性細胞被刺激因子激活后能夠產生炎癥介質，進而損害氣道壁和肺部組織[14,15]。COPD屬于嚴重的公共衛生問題，目前已被行業列入重大疾病慢病管理體系內。有關病理演變機制的研究已經證明：慢性氣道炎癥是關鍵，病情進展與肺對有害顆粒或氣體的異常炎癥反應有關[9,10]。

QT幾乎存在于所有植物中，作為人類正常飲食的一部分，已具有悠久歷史。隨著對QT生物和藥理活性研究逐漸深入，越來越多的研究證明QT對人體頗有裨益，包括抗癌、抗過敏、抗炎、抗動脈粥樣硬化和保心功能[16,17]。本研究也證實，對大鼠連續四周給藥(50 mg/kg)后，對大鼠體重、肺功能、肺泡結構和凋亡等進行檢測發現，與正常大鼠比較并未有明顯差異。說明重要制劑QT對生物體具有較小影響，對大鼠沒有明顯毒性作用。此外一些前瞻性研究表明QT可有效抑制冠狀動脈、肺動脈血管收縮和降低血壓的功效[18]。更有研究表明QT可以顯著逆轉肺動脈高壓的形成[19]。本研究結果顯示，QT可以顯著改善COPD大鼠肺損傷情況，降低肺泡細胞凋亡和炎癥因子水平，抑制凋亡發生和炎癥水平。

圖5 肺纖維化及各處理相關凋亡基因表達水平Fig.5 Fibrosis and apoptosis related makers were detected in alveolus pulmonis Note: A.Masson；B.Western blot.**.P<0.01 compared with the control group;##.P<0.01 compared with COPD group.Bars,SEs.

TGF-β1可以抑制多種細胞增殖并誘導上皮細胞凋亡，同時又可以誘導間質樣細胞增殖和向肌成纖維細胞分化，來促進傷口愈合和組織纖維化形成[20]。有研究表明，TGF-β1被認為是體內促纖維化生長因子最重要的分子。如IPF和博來霉素誘導的肺纖維化損傷中顯示TGF-β1表達增加[21]。TGF-β1體外可以激活成纖維細胞，體內過表達可以造成肺持續的纖維化進程[22]。TGF-β1調節肌成纖維細胞的主要方式是通過控制α-SMA來促進細胞外基質蛋白(膠原蛋白和黏聯蛋白)分泌；也有許多纖維化信號激活肌成纖維細胞功能的信號也由TGF-β1調節或激活[23]。TGF-β1一方面降低TNF-α活性來降低炎癥因子IL-6來抑制免疫炎癥[24-26]，IL-6是由多種細胞產生、具有誘導B細胞活化產生抗體的多功能細胞因子，可以通過凝聚膠原蛋白，抑制細胞外基質分解，刺激成纖維細胞增殖，導致COPD氣道纖維結締組織形成及平滑肌增生，從而參與COPD氣道重構[9,10]。而IL-10作為多效抗炎性細胞因子，具有重要的抗炎及免疫抑制作用[27]。本研究證明，COPD大鼠模型中TGF-β1和α-SMA的表達量急劇上升；但在經過QT治療后，TGF-β1和α-SMA的表達量明顯下調，接近正常組大鼠體內的表達水平，同時大鼠肺纖維化的程度也明顯緩解。

常見的凋亡途徑分為：內源性凋亡(線粒體途徑)和外源性途徑。內源性途徑常與細胞壓力應激相關，當細胞感受到壓力之后便會激活BH3，使抗凋亡因子Bcl-2降低，從而減少對凋亡促進因子Bax抑制，最終通過Caspase-9誘導Caspase3/6/7激活造成細胞發生凋亡；而外源性途徑則是依賴FASL，TNF-α及TRAIL與細胞上死亡受體結合后，進一步激活Caspase 8來誘導Caspase3/6/7激活造成細胞凋亡[28]。本研究發現COPD疾病模型組大鼠經過QT治療后，Caspase-3和Caspase-9都受到明顯下調。TGF-β信號分子在多種重要信號途徑中參與多細胞應答，如細胞增殖、分裂、凋亡、免疫及炎癥應答等[29-31]。TGF-β1可以結合TNF-α共同抑制Caspase-3依賴的凋亡通路來抑制凋亡發生。綜合研究結果可以證明，當COPD模型大鼠經過QT治療后可以顯著地降低TNF-α和TGF-β1的表達水平，有效降低下游Caspase-3和Caspase-9的活性，從而降低肺泡細胞凋亡發生。

綜上所述，QT對COPD有一定保護作用，通過降低TGF-β1、TNF-α和α-SMA活性來抑制細胞凋亡及降低細胞炎癥因子釋放。本研究通過COPD損傷大鼠模型初步探究QT在臨床治療COPD損傷方面具有相關性和可行性。但是QT在體內發揮功能的信號通路比較復雜，需要進一步明確其相關信號轉導機制并選擇關鍵靶點分子才能為精準治療慢性阻塞性肺疾病提供指導。