基于系統藥理學的骨碎補治療骨質疏松的通路及靶標探討*

趙金龍 ，曾令烽 ，趙 第 ，潘建科 ，韓燕鴻 ，梁桂洪 ，李嘉暉 ，劉 軍

（1.廣州中醫藥大學第二臨床醫學院，廣州 510405；2.廣東省中醫藥科學院骨與關節退變及損傷研究團隊，廣州 510120；3.廣州中醫藥大學第二附屬醫院，廣東省中醫院，廣州 510120）

骨碎補首載于《藥性論》，是水龍骨科植物槲蕨的根莖部分。在中醫學的草藥應用中，骨碎補用于多種骨傷科相關疾病，如肝腎不足引起的骨關節炎、腰肌勞損等[1]。根據中國最新的人口普查數據，2013年中國60歲以上老年人口約為2.02億，而到2050年此數據可上升至4億，中國骨質疏松患者或骨密度低的人群數量將達2.12億[2-3]，骨質疏松癥病患人群的不斷增長，必然會帶來一系列的社會、經濟等壓力。因此充分利用和發掘可用于抗骨質疏松的藥物，為抗骨質疏松提供更有效的藥物成分，是社會和醫學發展的迫切要求。隨著現代藥理學研究的發展以及臨床實踐的探索應用，骨碎補也被發掘應用于抗骨質疏松治療[4]。Cai YL等[5]的研究顯示，骨碎補可以作用于去勢骨質疏松大鼠，能增強實驗小鼠的骨密度，并改善骨小梁的顯微結構。臨床藥學中所應用的抗骨質疏松中成藥如強骨膠囊、骨疏康顆粒等，都包含有骨碎補這一味中藥成分[6]。骨碎補是中醫骨傷科廣泛應用的經典草藥，具有巨大的應用潛力，探討并發掘骨碎補在抗骨質疏松中的潛在機制，可有利于促進抗骨質疏松的臨床用藥進展。基于系統藥理學的生物信息學推導方法，對骨碎補的相關生物學、藥理學等生物信息數據進行分析，將從分子層面及通路領域探討骨碎補治療骨質疏松的生物學原理，以期為骨碎補的臨床推廣應用及開發新的可用于抗骨質疏松物藥提供有力的循證支持。

1 資料和方法

1.1 骨碎補的化學分子信息庫 本研究通過中藥系統藥理學分析平臺（TCMSP），以“骨碎補”作為中藥名檢索骨碎補的化學成分。

1.2 化合物的信息提取 通過口服方式表現出來的生物利用度是藥物動力學（ADME）中最重要的藥物代謝動力學的其中一個參數，其代表口服藥物到達體循環所占口服劑量的多少，作用比率高的口服生物利用度也許是決定生物活性分子類藥性的重要指標[7]。文章研究以口服生物利用度（OB）最低大于或等于30%和類藥性（DL）最低大于或等于0.18作為活性化合物的選取標準，將數據庫中具有較高活性的成分進行提取，以保證數據的有效性。

1.3 化合物與靶點網絡的構筑 將“骨碎補”相關的化合物及靶點通過軟件Cytoscape 3.5.1構筑化合物-靶點網絡，并對其進行拓撲學的數據分析，從而研討骨碎補的藥理學作用機制，其中靶點度值（Degree）和中介中心度（Betweenness Centrality）是拓撲學數據中兩個關鍵參數，可評判該方劑相關化合物和靶標的關鍵性。

1.4 蛋白互作（PPI）網絡的構建 蛋白質一般以相互組合的方式方能實現其生理學功能，因此蛋白相互作用網絡的分析及研究是理解生命活動如生理過程等的基礎條件。為了闡明靶點蛋白在系統層面的用途，將“骨碎補”相關的靶點輸入數據庫STRING 10.5，使用相關設置功能，將評分設為0.90及以上，以此提升信息的可信性。通過以上數據處理而導出蛋白互作的可視化圖，并根據相關數據提取相關靶標蛋白的關聯頻數。

1.5 KEGG通路富集分析 KEGG（Kyoto Enclopedia of Genes and Genomes）是東京大學和日本京都大學共同開發的數據庫，研究可以通過此信息庫進行相關通路的研究，且該信息庫與David在線互聯。為了闡明本研究中方劑中相關化合物的靶點蛋白在信號通路中的作用機制，文章采用David v6.8數據庫對靶點蛋白進行信號通路富集分析，從而分析骨碎補所涉及的相關通路。

2 結果

2.1 骨碎補的有效化合物數據 通過TCMSP共提取到骨碎補中有效化合物75種，以OB大于或等于30%及DL大于或等于0.18作為提取標準，篩選出活性化合物共18種，相關信息如表1所示。

2.2 骨碎補化合物-靶點互作網絡 化合物-靶點網絡中共計有185個節點（其中化合物節點共計有14個、靶點節點171個）和608條邊，其中化合物分子以紅色節點進行標注，藥物靶點以藍色節點進行標注，每條邊代表化合物和靶點之間相關性，見圖1。其中共有4個化合物未進行網絡構筑。在網絡中，一個節點的度值的多少代表網絡中節點之間相連邊的數量。根據網絡拓撲學的特點選取度值較大的節點進行探討分析。表2顯示了化合物-靶點網絡中的關鍵節點及其拓撲學性質。網絡拓撲學相關結果如下：網絡集中度：0.328，網絡密度：0.018，網絡異質性：2.340，最短路徑：34040（100%）。平均度值結果：3.286486486，大于平均度值的節點共計24個；節點平均中介中心度：0.01225238，大于平均中介中心度的節點共計29個。根據節點的度值和中介中心度等拓撲學特征選用核心節點分析。這些聯接化合物或靶點較多的節點在整個網絡中甚至起到決定性的作用，可能是核心的化合物或靶點。

表1 骨碎補化合物信息特征表Tab.1 Information characteristics of Gusuibu compound

圖1 化合物-靶標關系圖Fig.1 Compound-target relationship diagram

網絡拓撲學分析最后表明骨碎補的核心化合物有柚皮苷（naringenin）、圣草酚（eriodictyol）、山奈酚（kaempferol）等；重要的靶標有前列腺素G/H合成酶 2（Prostaglandin G/H synthase 2）、Heat shock protein HSP 90、Caspase-3等。

表2 化合物-靶標網絡節點及其拓撲學特征表Tab.2 Compound-target network node and topology feature table

柚皮苷（naringenin）是中藥骨碎補中的最主要成分之一，其為一種黃酮類化合物[8]，研究結果表明骨碎補中以柚皮苷為代表的黃酮類物質是一種類雌激素類的單體成分[9]，具有代替傳統雌激素藥物在人體中發揮相應的生物學作用。Pang等[10]研究結果表明柚皮苷這一具有類雌激素作用的單體成分，可能是激活城固細胞上配體依賴性的雌激素受體，從而發揮其抗骨質疏松的作用，證明了柚皮苷在激素水平上抗骨質疏松的作用。Wu JB等[11]研究結果發現，柚皮苷可促進蛋白激酶B（Akt）的磷酸化、cfos及c-jun的激活而促進BMP-2的表達，繼而發揮抗骨質疏松的作用。Li等[12]提出，柚皮苷通過促進相關成骨細胞的分化、促進成骨細胞的骨鈣蛋白表達，從而達到抗骨質疏松的作用。現代藥理學研究結果證明[13]，柚皮苷具有較強的抗炎作用，其抗炎機制可能是主要通過抑制核轉錄因子-κB（NF-κB）的表達，而NF-κB的表達對于炎癥因子腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、環氧合酶（COX-2）、白介素-6（IL-6）等均有促進作用。相關的動物實驗結果也表明，柚皮苷能夠顯著減少外周血中的炎癥因子含量，減少了TNF-α的表達[14]。

山奈酚（kaempferol）一種存在于多種中藥材中的黃酮類化合物，具有抗氧化、抗炎、抗骨質疏松等多種生物功能[15]。相關研究結果表明，山奈酚對去卵巢大鼠具有較好的抗骨質疏松治療作用，其研究發現山奈酚主要是通過抑制大鼠骨鈣的流失及骨吸收關鍵酶的活性，從而起到抗骨質疏松作用[16]。通過抑制前列腺素G/H合成酶2（Prostaglandin G/H synthase 2）的產生或釋放，也是抑制炎癥反應的一種重要途徑。最新的研究結果顯示[17]，許多植物藥材的總黃酮等均可以降低炎癥組織中前列腺素G/H合成酶2的含量，其作用亦與抑制炎癥因子前列腺素G/H合成酶2的產生和釋放有關。Cox團隊研究結果發現[18]，山奈酚可顯著性抑制前列腺素G/H合成酶2的產生[19]。

前列腺素 G/H合成酶 2（Prostaglandin G/H synthase 2）是一個與細胞炎癥反應的關鍵因素[20]。中性粒細胞調節炎癥的其中一個機制是促進Prostaglandin G/H synthase 2的分泌[21]。前列腺素G/H合成酶2又稱COX-2，是一種誘導性酶，在大多細胞中少量表達。當細胞受到促癌劑、促炎細胞因子等刺激時，COX-2表達會上調，進而參與炎癥的發生和發展[22]。許多研究結果表明，下調COX-2可以減輕炎癥反應[23-24]。

天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）及天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-9（Caspase-9）的細胞凋亡活化復合體激活，其結果會導致細胞凋亡。天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶（Caspase）家族是軟骨細胞凋亡調控的中心執行者[25]。Caspases是一種具有切割蛋白供血的生物酶，這種酶會引起細胞結構崩解，包括始動因子Caspase2、8、9及執行因子 Caspase 3、6、7[26]，Caspase3 被激活，細胞死亡將不可被逆轉[27]。劉嘉眉等[28]探討Caspase 3、9與絕經后骨質疏松癥發病機制的影響的研究顯示，在骨質疏松癥組中的案例Caspase-3、Caspase-9含量增加，這表明在骨質疏松癥組的成骨細胞凋亡過程中，Caspase依賴性凋亡途徑激活。有相關研究結果表明[29]，藥物的干預可以誘導相關信號通路及Caspases的激活來引導軟骨細胞的凋亡，這也可能提示筆者，可能骨碎補等中藥或其單體成分是通過Caspase-3等執行因子的作用，誘導相關的細胞凋亡，如成骨細胞等，這可能會促進骨質疏松的進展，同時也給予相關研究者予提示，通過干預相關Caspase-3等執行因子或啟動因子，從而起到阻斷成骨細胞凋亡等作用，進而阻礙骨質疏松癥的進展，起到抗骨質疏松的作用。另有研究顯示，杜仲葉中的抗氧化活性物質，可通過抑制Caspases 3、9等的表達，拮抗H2O2誘導的前成骨細胞MC3T3-E的凋亡，從而起到促進抗骨質疏松的作用。經過生物信息學的分析，Caspase-3這一靶點占據重要的地位，可能骨碎補發揮類似杜仲通過抑制成骨細胞的凋亡，從而起到抗骨質疏松的作用。

2.3 骨碎補PPI網絡的構建與分析 為了更好地理解與分析骨碎補的作用機制及原理，基于蛋白之間相互作用的關系，利用STRING構造了“骨碎補”相關靶標的蛋白互作網絡圖（見圖2）。設置置信度大于或等于0.90，去除孤立于網絡的相關靶標蛋白，得到的PPI網絡共計126個節點，1058條邊，平均度值：8.396825，其中節點代表靶標蛋白，每條邊表示靶標蛋白之間的關聯性。根據節點的度值繪制大于平均度值且度值較高的22個關鍵蛋白質節點的表格和雷達圖（見表3和圖3）。度值較高的5位分別為 JUN、TP53、MAPK1、RELA、AKT1。其中 JUN度值（度值為39）高于其他節點，說明這個蛋白在網絡中發揮了相對重要的作用，成為聯通網絡中其他節點的關鍵節點。

圖2 骨碎補靶蛋白互相作用網絡圖Fig.2 Target protein interaction network diagram of Gusuibu

表3 靶標蛋白名稱及其度值Tab.3 Target protein names and degree values

圖3 靶標蛋白頻次雷達圖Fig.3 Target protein frequency radar map

PPI網絡分析表明 JUN、TP53、MAPK1、IL-6、ESR1等靶蛋白度值遠高于其它。c-jun蛋白水平的循環變化在腺上皮細胞的增殖和凋亡中是顯著的。c-jun蛋白的持續基質表達可以防止基質細胞在晚期分泌期進入細胞凋亡[30]。RelA/p65為NF-Kβ的亞單位，且在炎癥反應及炎癥反應相關疾病的過程中有著重要的影響。NF-κB能夠引導單核巨噬細胞產生炎性細胞因子，如白細胞介素2、6、12等，從而引起強烈的炎癥反應[31]。研究顯示[32-33]，外源性物質刺激生物體可以引起機體TNF-α和白細胞介素6等促炎因子的分泌，從而抗炎因子水平會降低，因而引起細胞因子水平的不平衡等，最終使得體內炎癥的發生及發展。而近來的研究發現，骨質疏松的發生發展，與炎癥的內在聯系愈加緊密，LI-6、白介素-2（IL-2）等炎癥因子均能促進破骨細胞分化，增強骨吸收，從而促使骨質疏松癥的發生[34-36]。由此推測骨碎補可能是通過作用于JUN、RELA等靶蛋白，從而調整IL-2等促炎因子在體內的生物學活動，起到抗炎等生理功能，這與骨碎補在臨床上與動物實驗上應用于炎癥的干預相一致，從機制理論和臨床實際應用兩個層面證實了其抗炎作用。

雌激素受體1基因（ESR1）位于人染色體6q21上，雌激素與雌激素受體（ER）相互結合，可以介導目標基因的表達，從而參與骨的重構，同時相關結果也表明，ESR1與骨密度關系密切[37]。另有研究結果發現[38]，ESR1活化能夠抑制相關通路的磷酸化，由此可以促進自噬、抑制凋亡，從而促進細胞增殖，從而維持或促進骨量或軟骨的優勢變化。骨丟失、骨質疏松的發生發展和雌激素受體α蛋白表達異常相關，因此雌激素受體α蛋白表達異常，也會影響到ER的相關生物學進程，進而對人體的骨密度產生影響，推動或阻斷骨質疏松的發展進程[39]。Qu等[40]發現在成骨細胞上存在雌激素受體，在小鼠骨髓培養過程中，雌激素可通過ER依賴方式刺激成骨細胞的分化，從而起到抗骨質疏松的作用。Oreffo等[41]發現破骨細胞前體中有ESR1表達，但在破骨細胞成熟和進行骨吸收時ESR1表達消失，表明雌激素受體的表達和調控可能在破骨細胞的形成中發揮重要作用，對骨質疏松癥的控制表現為抑制骨吸收，促進骨形成。

2.4 KEGG通路富集分析 使用David v6.8數據庫對骨碎補靶蛋白基因進行信息通路富集，結果共有139條生物信息通路，計算每條富集通路的P值（P值小于0.01為顯著富集），去除部分具有普遍性和廣泛性的生物學通路，提取與骨碎補治療骨質疏松癥相關的或有可能成為關鍵途徑的生物學通路，并對其P值排序后取前10名進行分析。見表4。

表4 KEGG通路富集情況表（Top 10）Tab.4Outcome of KEGG pathway enrichment（Top 10）

為了更深層次探究骨碎補作用靶點在生物信號通路層面的機制，文章利用KEGG通路富集對骨碎補靶標基因進行研究，結果表明具有顯著統計學意義的10條相關通路分別是TNFsignalingpathway、T cell receptor signaling pathway、HIF-1 signaling pathway、PI3K-Aktsignalingpathway、Estrogensignaling pathway、Neurotrophin signalingpathway、Thyroid hormone signaling pathway、FoxO signaling pathway、cAMP signaling pathway、VEGF signaling pathway。由上述KEGG富集結果分析可知，骨碎補與TNF signalingpathway、PI3K-Aktsignaling pathway、Estrogen signaling pathway、cAMP signaling pathway、VEGF signaling pathway等相關通路有較大聯系。因此文章試圖從以上幾個主要方面進行機制探討與分析，試圖理解骨碎補在基因功能及信號通路層面的作用機制。

TNF signaling pathway經TNF與TNFR1結合而激活，激活的TNF信號通路可導致NF-κB核易位和JNK，p38，AP-1活化，促使促炎性細胞因子、趨化因子、生長因子和TNF-α本身等基因的表達[42]。近年來，許多研究認為，骨質疏松可能不僅與內分泌系統的紊亂，如雌激素缺乏等相關，同時也提出觀點：骨質疏松癥的生化進展與免疫系統功能失常而產生炎癥反應有直接關系[34]。許多炎性細胞因子如TNF、NF-κB 受體活化因子配體（RANKL）、IL-2、IL-6等參加了各類骨質疏松癥的生化進展，同時發揮著關鍵的作用[43-44]。而炎性細胞因子促進骨吸收或降低骨形成來打破骨轉換平衡，參與骨質疏松癥的發生和發展，因此阻斷炎癥反應已成為防治骨質疏松的重要靶點與途徑。在利用STRING10.5數據分析軟件進行PPI分析時也發現，TNF、IL-6、IL-2、RELA等靶蛋白的度值比較高。因此，骨碎補可能是通過其獨特的化合物或單體成分，通過TNF signaling pathway這一信號通路，發揮抗炎作用而起到抗骨質疏松的生化作用。

Estrogen signaling pathway亦可能是骨碎補發揮其抗骨質疏松作用的最重要通路之一。雌激素通過相關受體激活途徑的調節機制成骨細胞上存在腫瘤壞死因子受體等，且在成骨細胞的功能發揮中起重要作用，TNF-α等均屬于TNF超家族，許多實驗表明[45]誘導活化成骨細胞胞膜上受體Fas等可誘導成骨細胞凋亡，因此骨碎補相關有效成分可能通過Estrogen signaling pathway減少成骨細胞胞膜上受體Fas等受體的活化，從而減少成骨細胞凋亡，至少阻斷或延緩了骨質疏松平衡的加快打破。研究表明[45]成骨細胞上存在雌激素受體，在小鼠骨髓培養過程中，雌激素可通過ER依賴方式刺激成骨細胞的分化，從而起到抗骨質疏松的作用，因此骨碎補有關成分，可能是通過Estrogen signaling pathway調控相關成骨細胞上的ER，從而促進鈣鹽等的沉積，促進骨形成，從而起到抗骨質疏松的作用。

3 討論

文章運用系統藥理學的方法對骨碎補的作用機制及原理進行分子機制、基因及信號通路等層面的分析，結果發現骨碎補在抗骨質疏松治療方面具有很強的科學性，由化合物-靶標網絡分析可知其可能是通過柚皮苷等黃酮等類雌激素類化合物發揮其抗骨質疏松的生物學作用。由PPI分析、David通路富集分析可知骨碎補在理論上具有從抗炎、內分泌系統等途徑發揮抗骨質疏松的作用機制。此外，通過相關的生物學信息分析，筆者發現骨碎補與 Neurotrophin signaling pathway、Thyroid hormone signaling pathway、FoxO signaling pathway 等生物學通路關系密切，可能與骨質疏松有一定的關聯，但目前關于這方面的研究尚少，因此骨碎補是否與以上通路存在一定的生物學聯系以及在以上通路發揮抗骨質疏松的效用，尚需大量的臨床、實驗研究進行探索驗證，同時本課題為以后基礎實驗及藥物開發提供了一個新方向。