腎?、裉柗綄δI間質纖維化大鼠TGF-β1和CTGF表達的影響

劉張紅程錦國林文博武亞丹

1.浙江中醫藥大學附屬溫州中醫院 浙江,溫州 325000 2.浙江省中山醫院3.南京中醫藥大學附屬泰州中醫院

腎間質纖維化影響慢性腎臟疾病的進程，導致不可逆的腎功能損傷，慢性腎臟?。╟hronic kidney disease，CKD）患者的預后取決于腎間質纖維化的程度[1-2]。過量的細胞外基質（extracellular matrix，ECM）的沉積以及成纖維細胞的增生是腎間質纖維化的主要發病機制，眾多細胞因子及信號通路參與了腎間質纖維化的病理過程，其中轉化生長因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）[3]、結締組織生長因子（connective tissue growth factor，CTGF）[4]、核轉錄因子及Smad通路[3]、Wnt信號通路[5]在其中起著重要作用。

CKD發病率逐年增加，目前西醫對CKD的治療主要是針對基礎疾病及并發癥的治療，以延緩疾病進展。血管緊張素轉化酶抑制劑（angiotensin converting enzyme inhibitor，ACEI）和血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑（angiotensinⅡ receptor antagonist/angiotensinⅡ receptor blocker，ARB）是目前公認的具有腎臟保護作用的藥物，被廣泛應用于CKD的治療，但ACEI或ARB的臨床應用存在局限性，對于不伴高血壓的CKD患者和伴腎動脈狹窄的患者，ACEI或ARB類藥物需慎用。研究證實，近年來中醫藥治療CKD取得了較好療效[6-8]。腎?、裉柗绞钦憬嗅t藥大學附屬溫州中醫院程錦國教授總結長期臨床經驗研制出的抗腎間質纖維化基本方，具有較好的臨床療效[9-11]。前期實驗已證實，腎?、裉柗侥芟抡{白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）基因的表達，減少系膜細胞的增殖和纖維連接蛋白（fibronectin，FN）的分泌，抑制腎間質纖維化[10]。進一步研究發現，腎?、裉柗娇梢酝ㄟ^下調腎小管上皮細胞中Wnt4和β-catenin蛋白的表達，保護腎小管，減少ECM沉積，起到抗腎間質纖維化的作用[11]。本研究以腎間質纖維化大鼠模型為對象，觀察腎?、裉柗綄Υ笫竽I功能、腎間質纖維化和TGF-β1、CTGF表達的影響，進一步探討其可能的作用機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 SPF級健康成年雄性SD大鼠72只，體質量（200±20）g，購于上海斯萊克實驗動物有限責任公司[實驗動物生產許可證號：SCXK（滬）2012-0002]。動物飼養于溫州醫科大學動物實驗中心[實驗動物使用許可證號：SYXK（浙）2015-0009]，根據實驗動物護理和使用指南，分組分籠飼養，飼養環境溫度（20±2）℃，相對濕度為（50±5）%。

1.2 藥物與試劑 腎?、裉柗剑ú窈ⅫS芩、半夏、白芍、土茯苓、半枝蓮、菝葜、漏蘆等）煎劑，由浙江中醫藥大學飲片廠炮制中心提供，將藥物加水浸泡1h，水煎2次，每次50min，取汁混合后濃縮成生藥含量3g·mL-1的水煎劑；鹽酸貝那普利片購于北京諾華制藥有限公司（規格：10mg/片；批號：X2342）；抗 TGF-β1抗體和抗CTGF抗體購于Abcam公司（批號：ab5694、ab5097）；Masson染色試劑盒為北京索萊寶生物科技公司產品（批號：G1345）：DAB顯色試劑盒、超敏二步法免疫組化檢測試劑盒均購于北京中杉金橋公司（批號：ZLI-9019、PV-6001）。BX51 光學顯微鏡為日本Olympus公司產品；微量移液器購于德國Eppendorf公司。

1.3 造模與分組 72只大鼠按隨機數字表法分為假手術組、模型組、貝那普利組和腎?、裉柗浇M，每組18只。模型組、貝那普利組、腎?、裉柗浇M大鼠采用單側輸尿管結扎術造成單側輸尿管梗阻（unilateral ureteral obstruction，UUO），從而建立腎間質纖維化動物模型。大鼠右側臥位固定于手術臺，剪除左側腹部被毛，以10%水合氯醛3.5mg/kg腹腔注射麻醉，常規消毒，從背部距左側肋脊角1.5cm處行長約1.2cm的斜向切口，逐層剪開皮膚、肌肉，開腹后暴露左側腎臟，游離左輸尿管，在輸尿管上1/3處以3-0絲線雙重結扎左側輸尿管，然后逐層縫合。假手術組開腹后只分離左側輸尿管，但不結扎，其余操作同其他3組。所有大鼠均造模成功，無失敗或死亡。

1.4 給藥 術后第2天開始灌胃給藥，每日早晚各1次，共3周。假手術組和模型組以0.9%氯化鈉溶液10mL/kg灌胃，貝那普利組以0.08mg·mL-1貝那普利溶液0.8mg/kg灌胃，劑量參考文獻[11]；腎?、裉柗浇M以3g·mL-1腎?、裉柗剿鍎?0g/kg灌胃，劑量參考文獻[12]，為60kg體重正常成人每日生藥劑量的10倍。

1.5 標本采集 術后第7、14、21天，各組分別隨機選取6只大鼠，以10%水合氯醛3.5mg/kg腹腔注射麻醉后從腹主動脈采血，3 000r/min離心10min分離血清，使用全自動生化儀檢測血肌酐（serum creatinine，Scr）、血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）水平。并摘取左腎，剝除包膜，留取腎組織，以4%多聚甲醛溶液固定，石蠟包埋后切片。

1.6 指標觀察

1.6.1 腎間質纖維化程度觀察 各組腎組織石蠟切片行常規Masson染色，光鏡下觀察腎小管間質的病理變化情況。200倍光鏡下每張切片隨機選取5個非重疊視野，避開腎小球和大血管，測量每個視野中陽性染色的面積，取其平均值，根據其所占整個視野面積的百分比評定腎間質纖維化指數。標準如下：纖維化陽性面積＜2%計0分；纖維化陽性面積2%～10%計1分；纖維化陽性面積11%～20%計2分；纖維化陽性面積21%～30%計3分；纖維化陽性面積＞30%計4分。使用Image Pro Plus圖像分析軟件進行圖像面積分析。

1.6.2 腎間質纖維化相關因子蛋白表達檢測 石蠟切片常規脫蠟水化，加入3%H2O2室溫靜置10min后高壓熱修復，山羊血清封閉液室溫封閉20min，然后滴加抗 TGF-β1一抗（稀釋倍數 1：200）和抗 CTGF 一抗（稀釋倍數1：300），4℃過夜。根據超敏二步法免疫組化檢測說明滴加二抗，室溫靜置15min。DAB顯色、水洗、蘇木素復染、脫水、透明、封片。每張切片隨機選取6個非重疊視野，注意避開邊緣，使用Image Pro Plus圖像分析軟件計算累積光密度（integrated optical density，IOD），取其平均值進行統計分析。

1.7 統計學分析 采用SPSS 17．0統計軟件進行統計學分析。本研究計量資料均符合正態分布，以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t法；方差不齊時采用秩和檢驗。以P＜0．05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠腎功能比較 各組間比較，大鼠Scr和BUN水平存在統計學差異（P＜0．01）。與假手術組比較，其余3組大鼠Scr和BUN水平明顯升高，差異具有統計學意義（P＜0．05）。與模型組比較，貝那普利組和腎?、裉柗浇M大鼠血清 Scr和BUN水平顯著降低，差異有統計學意義（P＜0．05），而貝那普利組和腎?、裉柗浇M之間差異無統計學意義（P＞0．05）。見表 1。

2.2 各組大鼠腎間質纖維化指數比較 Masson染色提示，假手術組僅微量膠原組織染成藍色；模型組腎組織藍染膠原組織較多，且隨著時間推移，藍染面積增大，腎間質纖維化指數增加，與假手術組比較，差異有統計學意義（P＜0．05），提示腎間質纖維化呈進行性加重。而貝那普利組和腎?、裉柗浇M腎組織藍染膠原組織所占面積介于模型組和假手術組之間。與模型組比較，貝那普利組和腎病Ⅰ號方組腎間質纖維化指數顯著降低（P＜0．05），而貝那普利組和腎?、裉柗浇M之間差異無統計學意義（P＞0．05）。見表 2、圖 1。

表1 各組大鼠腎功能比較Tab.1 Comparison of renal function in each group

2.3 各組大鼠腎組織TGF-β1和CTGF表達比較

2.3.1 各組大鼠腎組織TGF-β1表達比較 假手術組大鼠腎組織可見微量TGF-β1表達，其余3組TGF-β1表達增強，其中貝那普利組和腎?、裉柗浇M表達弱于模型組。與相同時點假手術組比較，其余3組大鼠腎組織 TGF-β1表達均明顯增高（P＜0．05）；與相同時點模型組比較，貝那普利組和腎?、裉柗浇MTGF-β1表達減低（P＜0．05）。貝那普利組和腎?、裉柗浇M之間差異無統計學意義（P＞0．05）。見表 3、圖 2。

表2 各組大鼠腎間質纖維化指數比較（分）Tab.2 Comparison of renal interstitial fibrosis index in each group(scores)

圖1 各組大鼠腎間質纖維化情況比較（Masson染色，200×）Fig．1 Comparison of renal interstitial fibrosis in each group(Masson stain,200×)

2.3.2 各組大鼠腎組織CTGF表達比較 假手術組大鼠腎組織可見微量CTGF表達，其余3組CTGF表達增強，其中貝那普利組和腎?、裉柗浇M表達弱于模型組。與相同時點假手術組比較，其余3組大鼠腎組織 CTGF 表達均明顯增高（P＜0．05）；與相同時點模型組比較，貝那普利組和腎?、裉柗浇MCTGF表達減低（P＜0．05）；貝那普利組和腎?、裉柗浇M之間差異無統計學意義（P＞0．05）。見表 4、圖 3。

3 討論

腎間質纖維化是各種腎臟疾病進展到終末期的關鍵性進程，亦是CKD共同的病理生理特點，主要表現為系膜細胞過度增生，ECM沉積增多及成纖維細胞的異常增生，腎臟組織結構破壞和功能喪失。多種細胞因子及信號通路參與了腎間質纖維化過程，其中TGF-β1和CTGF在纖維化反應中發揮關鍵作用。TGF-β1一直被認為是促腎間質纖維化的關鍵因子之一，通過激活其下游的Smad信號通路，誘導腎間質纖維化的發生，腎間質纖維化發生和進展的全部過程都有 TGF-β1的參與[13]。研究證實，TGF-β1是腎小管上皮-間充質轉分化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）過程中的主要誘導因子[3]，抑制 TGF-β1的表達能夠延緩腎間質纖維化的進展[14]。CTGF是基質細胞蛋白家族成員，是腎小球和腎小管間質纖維化過程中的重要細胞因子，通過促進成纖維細胞的分裂增殖、膠原的沉積等方式促進纖維化的發生發展[15]，與TGF-β1協同促進腎間質纖維化[16]。研究發現，CTGF是TGF-β1的下游信號分子，具有促纖維化作用[17]。TGF-β1可誘導血管內皮細胞、平滑肌細胞、系膜細胞、成纖維細胞、腎小管上皮細胞中的CTGF表達，CTGF又可介導TGF-β1對腎間質細胞的作用，促進細胞增殖以及ECM的合成和沉積[18]。

表3 各組大鼠腎組織TGF-β1表達比較Tab.3 Comparison of TGF-β1expression in renal tissue in each group

圖2 各組大鼠腎組織TGF-β1表達水平比較（200×）Fig．2 Comparison of TGF-β1expression in renal tissue in each group(200×)

表4 各組大鼠腎組織CTGF表達比較Tab.4 Comparison of CTGF expression in renal tissue in each group

圖3 各組大鼠腎組織CTGF表達水平比較（200×）Fig．3 Comparison of CTGF expression in renal tissue in each group(200×)

CKD病程中腎素-血管緊張素系統活化，參與了腎間質纖維化的進程。阻斷或抑制腎素-血管緊張素系統活性目前已經成為延緩腎臟疾病進展的重要手段。ACEI或ARB可以抑制腎素-血管緊張素系統活性，通過降壓及非降壓作用阻斷腎間質纖維化的進程。貝那普利作為ARB的一種，是目前臨床常用的腎臟保護藥物，它可以通過抑制血管緊張素轉化酶，阻止血管緊張素Ⅱ生成，阻斷腎素-血管緊張素系統活化，從而實現腎臟保護作用。但ACEI和ARB不能阻斷腎素-血管緊張素系統的所有通路，對腎功能的保護作用有限，而且對于不伴高血壓、4期以后的CKD患者，以及伴有腎動脈狹窄的患者，ACEI和ARB類藥物屬于禁用或慎用范圍，其臨床應用具有一定的局限性。此外ACEI和ARB類藥物還存在諸多的不良反應，最常見的為頑固性干咳、過敏、胃腸道反應等，也影響了患者的治療依從性。

腎?、裉柗绞浅体\國教授的臨床經驗方，多年的臨床實踐證實其在治療CKD方面有較好的療效。程錦國教授認為CKD長期遷延不愈，其病機主要是三焦樞機不利，濕熱、瘀血、毒邪壅滯三焦。腎?、裉柗絼t是根據此病機特點研制而成的，采用小柴胡湯作為基礎方，配以土茯苓、半枝蓮、菝葜、漏蘆等清熱解毒、軟堅散結的藥物，疏利三焦，使三焦樞機調暢。方中小柴胡湯調暢三焦，土茯苓、半枝蓮清熱除濕解毒，菝葜解毒化瘀，漏蘆清熱解毒?，F代藥理學研究發現，小柴胡湯能夠調節慢性腎炎患者機體免疫功能，從而改善炎癥[19]。黃芩的主要成分黃芩苷能通過抑制Notch1信號通路抑制TGF-β1的表達，減輕腎間質纖維化[20]。土茯苓的主要有效成分土茯苓總黃酮能通過下調TGF-β1的表達，改善腎功能并減輕腎間質纖維化[21]。漏蘆能抑制腎TGF-β1和CTGF的表達，從而保護腎功能[22]。

本課題組前期研究發現，腎病Ⅰ號方具有抗腎間質纖維化作用[9-11]，能夠抑制大鼠系膜細胞增殖和FN的分泌，下調IL-6和CTGF的mRNA表達，減少腎小球系膜細胞Ⅳ型膠原的分泌，下調腎小管上皮細胞中Wnt4和β-catenin蛋白的表達，減少ECM沉積，保護腎小管。本研究建立了腎間質纖維化大鼠模型，予腎病Ⅰ號方水煎劑或貝那普利干預治療，研究結果表明，腎病Ⅰ號方在一定程度上確實能夠改善大鼠腎間質纖維化，腎?、裉柗浇M和貝那普利組大鼠各時間點的腎功能指標、腎間質纖維化指數低于模型組，TGF-β1和CTGF表達也明顯降低。與貝那普利組比較，腎病Ⅰ號方組各時點腎功能指標和腎間質纖維化指數差異均無統計學意義，TGF-β1和CTGF表達差異亦無統計學意義，說明腎?、裉柗降淖饔门c貝那普利相當。由此筆者推測，腎病Ⅰ號方能通過抑制TGF-β1及其下游信號分子CTGF的表達，減輕腎小管上皮細胞EMT，在一定程度上發揮抗腎間質纖維化作用，從而延緩CKD的疾病進程。

綜上所述，本研究證實腎病Ⅰ號方具有較好的抗腎間質纖維化作用，作用與貝那普利相當，其作用機制可能與下調TGF-β1和CTGF在腎組織中的表達有關，但更詳細的分子機制尚需進一步深入研究加以證實。