氨和空氣暴露對大鱗副泥鰍血漿皮質醇、乳酸及血糖含量的影響

丁淑荃，陳 范，馬 歡，謝云軼，毛穎睿，王光毅，金 慧，董昭然，張云龍

(安徽農業大學動物科技學院，合肥 230036)

氨對水生動物具有極強的毒性[1]，而一些氣呼吸型魚類，如泥鰍(Misgurnusanguillicaudatus)[2]、大鱗副泥鰍(Paramisgurnusdabryanus)[3-5]等，可耐受非常高的體內或體外氨。其主要原因是這些氣呼吸型魚類具有一些特殊的氨耐受策略[1,6]。盡管如此高濃度的體內或體外氨并不能對這些氣呼吸型魚類造成致死效果，但仍舊會引起強烈的應激反應。當動物處于某種不良條件下會引起應激反應，從而在表觀水平或生理水平上影響其完整性[7]。通常來說，應激會對魚類造成多種不良反應，如降低生長速度[8]、形態學變化[9]、降低免疫力[10]及改變生理生化指標[11]等。相較于陸生動物，魚類所面臨的應激因子更為廣泛，包括物理(如運輸、裝載及捕撈)[12-13]和環境(如擁擠、低氧、污染物、溫度、鹽度及營養不良)[10,14-16]因子。生理學響應是魚類中最常用的應激評價指標。其中，血漿皮質醇、血糖及乳酸含量是最常用的評價指標[11-12,17]。

大鱗副泥鰍是東亞地區重要的特種養殖品種之一[18-19]，據中國漁業統計年鑒(2019)報道，我國2018年度泥鰍(包括泥鰍、大鱗副泥鰍和臺灣泥鰍)的養殖總產量為35.84萬噸，總產值約為71.68億元[20]。自然條件下，其棲息于淺水區域且經常面臨階段性的干旱環境。當棲息地缺水時，大鱗副泥鰍會鉆入濕潤的泥土中，以后腸作為輔助呼吸器官，直接呼吸空氣[21]。在這種條件下，大鱗副泥鰍首先需要解決的問題應該是體內氨的累積。前期研究結果表明大鱗副泥鰍具有幾種獨特的氨耐受策略以應對過高的體內或體外氨累積[3,5]。然而，大鱗副泥鰍對高濃度環境或體內氨的應激相應仍不清楚。因此，本研究旨在闡明大鱗副泥鰍對高濃度環境和體內氨的生理相響應，為大鱗副泥鰍適應體內外氨累積的機制提供理論依據。

1 材料方法

1.1 試驗魚

試驗用大鱗副泥鰍(25±4)g由合肥市周邊的水產養殖場獲得。試驗魚運至實驗室后暫養于60 L的水族箱中(盛水50 L)，實驗開始前暫養7 d，實驗期間室溫24～26 ℃。暫養期間內，每天換水，換水量為30%左右，養殖用水在實驗室內曝氣96 h，水溫與室溫相同，水族箱每天連續充氣，每天投喂兩次商品飼料(粗蛋白35%，粗脂肪7%)。實驗開始前24 h停止投餌。

1.2 實驗設計

實驗設置空氣暴露組、氨暴露組和對照組3個組。將大鱗副泥鰍置于圓形塑料盆(直徑35.5 cm，高15.5 cm)中進行空氣暴露，盆中裝有很薄的一層蒸餾水(100 mL)以保持大鱗副泥鰍體表濕潤，盆中的蒸餾水每隔8 h徹底更換一次以保證盆中的濕度。將大鱗副泥鰍置于圓形塑料盆(直徑35.5 cm，高15.5 cm)中，盆中裝有10 L 30 mmo/L的NH4Cl溶液(以4 mol/L NaOH溶液調節pH至7.2)，以此進行氨暴露，盆中的NH4Cl溶液每隔24 h徹底更換一次以避免氨揮發造成的氨濃度降低。將4尾大鱗副泥鰍置于圓形塑料盆(直徑35.5 cm，高15.5 cm)中，盆中裝有10 L 曝氣后的蒸餾水，以此作為對照組，盆中蒸餾水每隔24 h徹底更換一次。3個組的暴露時間均設置為0、12、24、 48、72及96 h，每個暴露時間點均設置三個平行組，每個平行放置4尾魚。實驗期間，實驗室內溫度為(24±1)℃，所有試驗用水均在實驗室內靜置96 h以上，以保證水溫與室溫一致。

1.3 樣品采集及處理

每個暴露時間點結束，該時間點三個平行中的所有試驗魚均以MS-222徹底麻醉。隨后以1 mL注射器從尾靜脈取血，置于肝素鈉潤洗過的抗凝管中。取血后，在離心力4 000g、溫度4 ℃的條件下離心30 min，取上清液制備血漿。每個平行中的血漿由4尾試驗魚合并而來。所有樣品均保存于-80 ℃的冰箱中待測。

1.4 生理指標檢測

血漿皮質醇含量以酶聯免疫法通過商業試劑盒測定(no.H094,Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute,China)，反應溫度為37 ℃，檢測波長為450 nm，以酶標儀(華東電子DG5033A)檢測，單位為mmol/L。血糖和血漿乳酸含量通過商業試劑盒(no.F006 and A019-2,Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute,China)測定，反應溫度均為37 ℃，檢測波長分別為505 nm和530 nm，以紫外可見分光光度計檢測，單位均為mmol/L。

1.5 數據處理

所有數據均以平均值±標準差表示，數據分析以SPSS 18.0 (SPSS Inc.Chicago,IL,USA)進行。先以Levene’s檢驗進行方差同質性檢驗，隨后進行單因素方差分析(ANOVA)檢測結果的顯著性水平，如果顯著則進行Duncan’s多重比較。以t-檢驗分析同一時間點試驗組與對照組之間的顯著性。顯著性水平為α=0.05。

2 結果

2.1 血漿皮質醇水平

不同時間氨和空氣暴露后，大鱗副泥鰍血漿中皮質醇含量的變化如圖1所示。氨和空氣暴露顯著影響大鱗副泥鰍血漿皮質醇含量。氨暴露大鱗副泥鰍24 h內，其血漿皮質醇含量顯著增加，隨后則顯著下降，氨暴露72～96 h后血漿皮質醇含量保持基本穩定。12～96 h的空氣暴露后，空氣暴露組中血漿皮質醇含量均顯著高于對照組。相似地，氨暴露大鱗副泥鰍12 h內，其血漿皮質醇含量也呈現顯著增加的趨勢，隨后則顯著下降，至72 h后則降至對照組水平。氨暴露12、24和48 h后，氨暴露組中血漿皮質醇含量顯著高于對照組。

圖1 空氣和氨暴露對大鱗副泥鰍血漿皮質醇含量的影響Fig.1 Effects of various periods of aerial and ammonia exposure on the contents (mmol/L,n=3) of the affected cortisol in the plasma of P.dabryanus

不同大寫字母表示不同時間空氣暴露之間差異顯著，不同小寫字母表示不同時間氨暴露之間差異顯著，不同阿拉伯數字表示對照組之間差異顯著，*表示空氣或氨暴露組與對照組之間差異顯著。下同。

2.2 血糖含量

圖2所示為氨和空氣暴露對大鱗副泥鰍血糖含量的影響。空氣暴露大鱗副泥鰍12 h內并沒有顯著影響其血糖含量。而空氣暴露12 h后，大鱗副泥鰍血糖含量顯著增加，直至試驗結束。而且，在空氣暴露24 h后，空氣暴露組血糖水平均顯著高于對照組。而氨暴露大鱗副泥鰍12 h內，其血糖含量顯著增加。氨暴露12～72 h內，其血糖含量呈緩慢增加的趨勢。而氨暴露大鱗副泥鰍72 h后，其血糖含量顯著增加，直至試驗結束。氨暴露大鱗副泥鰍12～96 h后，氨暴露組中血糖含量均顯著高于對照組。

圖2 空氣和氨暴露對大鱗副泥鰍血糖含量的影響Fig.2 Effects of various periods of aerial and ammonia exposure on the contents (mmol/L,n=3) of the affected glucose in the plasma of P.dabryanus

2.3 血漿乳酸含量

從圖3中可看出，空氣暴露大鱗副泥鰍48 h內，其血漿乳酸含量的變化并不顯著，但隨后顯著增加至穩定水平，直至試驗結束。空氣暴露大鱗副泥鰍72 h和96 h后，空氣暴露組血漿乳酸含量顯著高于對照組。而氨暴露大鱗副泥鰍則導致其血漿乳酸含量顯著上升，并在暴露12 h后到達峰值。隨后，血漿乳酸含量則顯著降低并在暴露96 h接近對照組水平。氨暴露大鱗副泥鰍12～72 h，氨暴露組中血漿乳酸含量顯著高于對照組。

圖3 空氣和氨暴露對大鱗副泥鰍血漿乳酸含量的影響Fig.3 Effects of various periods of aerial and ammonia exposure on the contents (mmol/L,n=3) of the affected lactate in the plasma of P.dabryanus

3 討論

在應激狀態下，血漿皮質醇和血糖含量是最常用的應激評價指標[11,22]。本研究中，氨和空氣暴露顯著影響大鱗副泥鰍血漿皮質醇和血糖含量，而前期大量的研究結果也得出了類似的結論。在魚類中，神經系統感受到外界環境的變化會迅速刺激腎上腺素的分泌，隨后會通過下丘腦-垂體-腎間細胞系統分泌皮質醇，從而導致血漿皮質醇含量上升[12,22-23]。應激導致的血漿皮質醇上升是非常迅速[24]的并且在應激過程中能持續保持較高水平。本研究中，大鱗副泥鰍血漿皮質醇含量在空氣暴露24 h內和在氨暴露12 h內顯著增加(圖1)，說明體內和體外氨累積對大鱗副泥鰍造成明顯的應激反應。隨后，大鱗副泥鰍血漿皮質醇含量則呈現顯著降低的趨勢(圖1)，這可能是因為大鱗副泥鰍體內的氨耐受策略開始起作用，從而促進體內皮質醇的清除。前期研究已證實大鱗副泥鰍具有幾種有效的氨耐受策略[3-5]，而在其他氣呼吸型魚類中的研究也證實了這一結論的可靠性[6]。動物體內皮質醇的代謝主要在肝臟中進行[25]，且受到多種環境因素的影響，如鹽度等[24]。盡管本研究中的應激因子持續至試驗結束，但大鱗副泥鰍血漿皮質醇含量仍在空氣或氨暴露一段時間后顯著降低，甚至在氨暴露72 h后達到對照水平。本研究結果表明，大鱗副泥鰍擁有的氨耐受策略可起到抗體內或體外氨累積應激的作用。

魚類血糖含量的上升也屬于應激第一階段[23]。這會誘導機體糖異生和糖酵解作用[22]，從而導致血糖含量上升，這一階段被稱為應激第二階段[26]。本研究結果顯示氨和空氣暴露可引起大鱗副泥鰍血糖含量顯著上升(P<0.05，圖2)，類似的研究結果還可見于斑點叉尾鮰(Ictaluruspunctatus)[11]、團頭魴(Megalobramaamblycephala)[16]、大西洋鮭(Salmosalar)[17]及草魚(Ctenopharyngodonidella)[27]等。這一現象在魚類中普遍存在，因為魚類在應激狀態下所需的能耗更多。而且，血漿皮質醇含量的上升也被證實會誘導機體血糖含量的上升[12]。然而，在虹鱒(Oncorhynchusmykiss)[28]和塞內加爾鰨(Soleasenegalensis)[29]的研究中卻得到了相反的結果。因此，需要精準檢測出魚類血漿基礎皮質醇水平，以此來評估皮質醇上升誘導的血糖上升。另一方面，魚類對葡萄糖利用的機制至今仍未被闡明[30]。所以，后續的研究應側重于魚類基礎皮質醇水平的精準檢測及魚類對葡萄糖的利用機理。

乳酸是魚類肌肉無氧代謝的產物。前期研究結果表明，魚類在應激狀態下肌肉中乳酸的生成量更大，隨后會導致血漿乳酸含量上升。相關研究可見長吻裸頰鯛(Lethrinusminiatus)[31]、圓口銅魚(Coreiusguichenoti)[32]、點帶石斑魚(Epinepheluscoioides)[33]及與米氏葉吻銀鮫(Callorhinchusmilii)[34]等種類。空氣和氨分別暴露大鱗副泥鰍72 h后和12 h內，其血漿乳酸含量顯著上升(P<0.05，圖3)。相似地，南美白對蝦(Litopenaeusvannamei)暴露于氨氮中也會導致其血漿乳酸含量顯著升高，這說明水生動物在氨應激狀態下會誘導機體進行補償性無氧代謝[35]。血漿乳酸含量的上升意味著機體缺氧或劇烈的運動。本研究中，氨暴露大鱗副泥鰍12 h后，其血漿乳酸含量顯著降低，且在暴露96 h時接近對照水平(P<0.05，圖3B)。同時，其血漿皮質醇含量也呈現明顯的下降趨勢(圖1)，說明大鱗副泥鰍體內的氨耐受機制起到了很好的抗氨應激作用。眾所周知，乳酸作為一種無氧代謝產物，其對機體是有害的[13]。然而，對斑馬魚(Daniorerio)的研究結果卻表明，在寒冷脅迫下，乳酸的后續利用可作為維持其腦細胞生理機能的重要能量源[36]。這也為魚類氨應激提供了另一個可選的研究方向。

4 結論

綜上，氨和空氣暴露可提高血漿皮質醇、血糖及乳酸含量誘導大鱗副泥鰍進入應激第一和第二階段。本研究表明大鱗副泥鰍的氨耐受策略可有效緩解體內和體外氨累積對其造成的應激反應。后續研究應該側重于魚類基礎皮質醇水平的精準測定以及葡萄糖和乳酸的后續利用。