腸桿菌科細菌質(zhì)粒介導氨基糖苷類耐藥基因研究進展

施清喻，胡付品

作者單位： 復旦大學附屬華山醫(yī)院抗生素研究所，國家衛(wèi)健委臨床藥理重點實驗室，上海 200041。

氨基糖苷類抗菌藥物（aminoglycosides）通過結合原核生物30S核糖體亞基16S rRNA的高保守A位點，干擾細菌蛋白質(zhì)的合成導致細菌的死亡[1]，現(xiàn)用于臨床革蘭陰性菌所致嚴重感染的治療及畜牧業(yè)中。按其作用部位可分為：①與A位點結合，4，6-二取代脫氧鏈霉胺類（如卡那霉素和慶大霉素）；4，5-二取代脫氧鏈霉胺類（如新霉素）。②非與A位點結合（如鏈霉素和大觀霉素）[2]。

但氨基糖苷類抗菌藥物由于其不良反應，且隨著廣譜抗生素的出現(xiàn)，臨床應用逐漸減少。近年多重耐藥腸桿菌科細菌不斷出現(xiàn)，但首選治療藥物碳青霉烯類耐藥性卻逐年上升。耐碳青霉烯類腸桿菌科細菌（CRE）被列為三大最緊迫的抗菌藥物耐藥威脅之一。現(xiàn)推薦的CRE感染治療方法是單用或聯(lián)合用氨基糖苷類、替加環(huán)素、黏菌素和新開發(fā)的頭孢他啶-阿維巴坦（avycaz）[3]。其中氨基糖苷類的治療失敗率較低[4]，且隨著國家監(jiān)管力度的增強其使用安全性也得到了提高。但隨著臨床應用，氨基糖苷類的耐藥性逐年上升。其中會導致氨基糖苷類廣泛高水平耐藥的16S rRNA需要引起臨床警惕，現(xiàn)就其基因環(huán)境及表達調(diào)控研究進行綜述。

1 質(zhì)粒介導16S rRNA甲基化氨基糖苷類耐藥機制

氨基糖苷類的常見耐藥機制有：①細菌的細胞膜通透性改變、內(nèi)膜轉(zhuǎn)運降低及主動外排加強。②細菌的核糖體蛋白、16S rRNA突變導致抗菌藥物作用靶位改變。③細菌產(chǎn)生氨基糖苷鈍化酶，這是最常見的一種機制。氨基糖苷鈍化酶包括N-乙酰轉(zhuǎn)移酶（aminoglycoside acetytransferase，AAC）、O-腺苷轉(zhuǎn)移酶（aminoglycoside nucleotidyltransferase，ANT； aminoglycoside adenylase，AAD） 和O-磷酸轉(zhuǎn)移酶 （aminoglycoside phosphotransferase，APH）。鈍化酶的修飾鈍化作用具有底物專一性，但存在雙功能鈍化酶，如AAC（6'）-APH（2"）酶可同時作用于6'位氨基和2"位羥基。這種酶在金葡菌、腸球菌中較為多見，在革蘭陰性菌中罕見。

氨基糖苷類抗菌藥物是由鏈霉菌屬、 小單孢菌屬等放線菌產(chǎn)生的，這些放線菌通過產(chǎn)16S rRNA甲基酶形成耐藥。根據(jù)甲基化的位點可將氨基糖苷類耐藥酶分為兩類：①A1408的N1位點甲基化，發(fā)現(xiàn)于產(chǎn)天神霉素的鏈霉菌屬，主要包括KgmB、NbrB、Kmr，導致對卡那霉素和安普霉素耐藥，但對慶大霉素敏感；②G1405的N7位點甲基化，發(fā)現(xiàn)于產(chǎn)慶大霉素絳紅小單孢菌，主要包括Grm、Sgm、FmrO，導致對卡那霉素和慶大霉素耐藥，對安普霉素敏感。兩者均作用于16S rRNA的A位點，它們的甲基化會阻止肽酰tRNA由A向P位點的轉(zhuǎn)移，干擾蛋白質(zhì)翻譯[1]。

這一機制原不存在于臨床分離株中，但自2003年起，這種酶出現(xiàn)在臨床菌株中[5-6]。16S rRNA甲基化酶通過使16S rRNA的A位點特定核苷酸的甲基化，阻礙氨基糖苷類藥物與核糖體30S亞基結合，導致耐藥。先發(fā)現(xiàn)的ArmA、RmtA～RmtH作用于G1405位點，破壞與4，6-二取代脫氧鏈霉胺的結合[7]。而NpmA作用于A1408位點，同時阻礙了4，5-和4，6-二取代脫氧鏈霉胺[2]。除了會導致多種氨基糖苷類高水平耐藥，16S rRNA甲基化酶位于可移動的質(zhì)粒或轉(zhuǎn)座子上易于傳播，需引起廣泛關注。

2 腸桿菌科質(zhì)粒介導16S rRNA甲基化酶基因相關研究

現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)10組甲基化酶：ArmA、RmtARmtH、NpmA[8]，見圖1。2002年首次檢測出16S rRNA甲基化酶[9]，2003年，Galimand等[5]發(fā)現(xiàn)其為ArmA。armA基因多位于可轉(zhuǎn)移質(zhì)粒的復合轉(zhuǎn)座子上，后發(fā)現(xiàn)也可存在IS26或ISAba125復合轉(zhuǎn)座子相關的獨立環(huán)狀結構，與宿主質(zhì)粒共存[10]，仍不明確其確切起源。同年發(fā)現(xiàn)的RmtA，其基因位于接合型質(zhì)粒中的耐汞轉(zhuǎn)座子Tn5041上，在移動元件κ-γ的兩個拷貝之間，該基因可能源于產(chǎn)氨基糖苷放線菌[11]。2004年，Doi等[12]發(fā)現(xiàn)RmtB，其基因與rmtA核酸序列相似性高。ArmA和RmtB是世界范圍報道最多的16S rRNA甲基化酶，雖然兩者都易攜帶blaCTX-M，但rmtB與blaCTX-M位于不同的質(zhì)粒[13]。2006年在奇異變形桿菌中發(fā)現(xiàn)RmtC[14]，與之前發(fā)現(xiàn)的16S rRNA甲基化酶相似性不高。RmtC的檢出率在一些地區(qū)僅次于ArmA和RmtB[15]。2007年，在巴西分離出同時產(chǎn)SPM-1金屬酶和RmtD的細菌[16]，在幾年后又發(fā)現(xiàn)了rmtD2[17]與rmtD3[18]基因型。現(xiàn)RmtD相關報道主要集中于巴西，且有一定概率同時產(chǎn)SPM-1[19]。2010年RmtE首次分離自牛源性大腸埃希菌[20]，后在2013年于人體分離出[21]，5年后發(fā)現(xiàn)rmtE2基因型[22]，至今相關報道依舊十分罕見。2011年，在法國發(fā)現(xiàn)了RmtF，與RmtD編碼蛋白一致性較高[23-24]，其可能與放線菌的16S rRNA甲基化酶存在親緣關系[25]。2011年在巴西篩選出 5株產(chǎn)RmtG細菌，這5株均同時產(chǎn)CTX-M，有4株產(chǎn)KPC-2[26]。早先RmtG的報道主要在美洲[27]，2018年首次在歐洲出現(xiàn)[28]。2 年后檢測出RmtH[29]，該菌株同時攜帶blaCTX-M-15、blaSHV-1、blaOXA-1[30]。2007年發(fā)現(xiàn)了卡那霉素-阿泊拉霉素甲基轉(zhuǎn)移酶（Kam）家族的NpmA[2]。NpmA可能擁有m（1）A1408和m（1）G1408的雙重活性[31]。現(xiàn)在產(chǎn)NpmA的菌株依舊較為罕見。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)16S rRNA甲基化酶基因的相關研究見表.[32-45]。

圖1 革蘭陰性菌和放線菌16S rRNA甲基化酶無根樹圖

3 質(zhì)粒介導16S rRNA甲基化酶氨基糖苷類耐藥的臨床策略

氨基糖苷類抗菌藥物適合作為治療CRE的聯(lián)合用藥，特別是新一代氨基糖苷類plazomicin，在體外對多藥耐藥腸桿菌科細菌具有殺菌活性，包括產(chǎn)生廣譜β內(nèi)酰胺酶[46]、碳青霉烯酶[47]和大多數(shù)氨基糖苷鈍化酶[48]類細菌。但其體外活性會受16S rRNA甲基化酶的影響[48]。需警惕攜帶16S rRNA甲基化酶基因的CRE越發(fā)頻繁地出現(xiàn)。

而質(zhì)粒介導16S rRNA甲基化酶作為氨基糖苷類新發(fā)現(xiàn)耐藥機制，雖未暴發(fā)性流行，但卻呈全球分布的趨勢。而在中國國內(nèi)，2004年首次在臺灣出現(xiàn)ArmA的相關報道[49]，后在2012年國內(nèi)分離出了RmtB[50]，它們是國內(nèi)分離率最高的2種16S rRNA甲基化酶。近年又分別檢出了RmtE[51]、NpmA[25]、RmtA[52]。需要警惕的是，由于氨基糖苷類藥物在獸醫(yī)學中的廣泛運用，動物中出現(xiàn)了產(chǎn)16S rRNA甲基化酶的致病菌株[9，43]，可能通過食物向人類傳播。

表1 16S rRNA 甲基化酶相關基因

此外16S rRNA甲基化酶由于其耐藥特性，也需臨床的充分重視。其一，16S rRNA甲基化酶會介導革蘭陰性桿菌對大多數(shù)臨床常用氨基糖苷類抗菌藥物極高水平耐藥，且無法通過提高劑量糾正。其二，所有已知的16S rRNA甲基化酶的結構基因均位于可轉(zhuǎn)移的質(zhì)粒，且與可移動遺傳因子相關聯(lián)，導致水平傳播。其三，這些細菌易發(fā)展為多重耐藥，尤其是與各種β內(nèi)酰胺酶基因聯(lián)合耐藥。所以盡早篩選出16S rRNA甲基化基因?qū)εR床的預防和治療相當重要。

在檢測16S rRNA甲基化酶時，較易與產(chǎn)多種鈍化酶的細菌混淆，且兩者可同時存在。卡那霉素的衍生物阿貝卡星可抵抗鈍化酶的作用，僅少數(shù)產(chǎn)雙功能酶可導致耐藥，若其高水平耐藥則懷疑產(chǎn)16S rRNA甲基化酶。有建議當出現(xiàn)對所有氨基糖苷類藥物耐藥的腸桿菌科細菌、不動桿菌或銅綠假單胞菌時，先進行慶大霉素、阿米卡星的紙片擴散法藥敏試驗，若可獲得阿貝卡星也應檢測，確認無抑菌圈后進行多重PCR，以此檢測16S rRNA甲基化酶基因[6]。

當在臨床遇到產(chǎn)16S rRNA甲基化酶革蘭陰性菌時，應該高度關注其抗菌譜，可篩選是否產(chǎn)超廣譜β內(nèi)酰胺酶（ESBL）。當接觸高度疑似或確診產(chǎn)16S rRNA甲基化酶和ESBL或產(chǎn)金屬β內(nèi)酰胺酶細菌感染的患者時，需采取一定的接觸預防措施。

4 結語

雖然人們還未明確16S rRNA甲基化酶的來源，但由于其可介導多數(shù)氨基糖苷類抗菌藥物高水平耐藥，基因結構可移動性且易形成多重耐藥的特性，使其成為臨床治療的嚴重問題。截止目前，在世界各地紛紛出現(xiàn)了產(chǎn)16S rRNA甲基化酶細菌，在我國也出現(xiàn)了相應報道。不同地區(qū)產(chǎn)酶基因的分布情況存在較大差異，可在相應地區(qū)進行流行病學調(diào)查，分析其傳播途徑，揭示其基因環(huán)境，這將對臨床治療與藥物研發(fā)提供幫助。對于醫(yī)務人員和流行病學工作者，早期篩查攜帶該基因的病原菌，加強對此類耐藥菌株的監(jiān)控，以防止其廣泛傳播至關重要。