水通道蛋白9在結腸癌組織中的表達變化及其過表達對結腸癌細胞侵襲和遷移的影響

軒福明，范仁根，蘇鳳連，查文章，鄒琳，秦呈林

(徐州醫科大學鹽城臨床學院，江蘇鹽城224000)

結直腸癌是常見的消化道惡性腫瘤，其發病率高、病死率高，嚴重威脅人們的生存質量。手術及新輔助化療作為治療的主要手段，有效降低了結直腸癌的局部復發率，在一定程度上提高了患者生存期，但很多存在腹腔轉移的患者治療效果不佳，合并腹腔轉移者的5年生存率明顯低于未轉移者[1]。腫瘤的高侵襲轉移潛能是腫瘤難以根治的重要原因，研究顯示，上皮細胞間充質轉化(EMT)在腫瘤的侵襲轉移過程中具有重要作用[2]。水通道蛋白(AQP)是一組廣泛存在于真核和原核生物細胞膜上的選擇性高效轉運水分子的特異性孔道，參與細胞內外水分子的轉運。文獻報道，AQP9參與了癌癥的發生發展和轉移[3，4]，并可在一定程度上影響結腸癌的化療效果[5]。AQP9在結腸黏膜中表達，但其在結腸癌轉移中的研究鮮有報道。2018年1月～2019年1月，我們觀察了AQP9在結腸癌組織中的表達，并分析AQP9過表達對結腸癌細胞侵襲和轉移的影響，探討其與EMT的關系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 結腸癌組織標本來源 選擇鹽城市第一人民醫院2018年1月～2019年1月收治的33例結腸癌患者，男16例、女17例，年齡(65.0±10.7)歲。左半結腸癌24例、右半結腸癌9例。患者均接受全系膜結腸癌根治術(術前未行輔助化療)，取手術切除的腫瘤組織及癌旁組織，固定于4%甲醛溶液中，用石蠟包埋。術后病理檢查證實腫瘤組織為結腸腺癌、癌旁組織為正常腸組織。本研究經醫院倫理委員會審核，患者及家屬均簽署知情同意書。

1.1.2 細胞與試劑 結腸癌HCT116細胞株購自南京凱基生物公司，羊抗小鼠IgG、抗AQP9兔多克隆抗體購自中國上海Sangon Biotech公司，pcDNA3.1購自武漢轉導生物公司，Anti-Vimentin、Anti-E Cadherin、GAPDH購自中國Abcam公司，Transwell小室、基質膠購自美國Corning公司、0.25% Tripsin-EDTA購自南京端粒公司、PVDF膜購自美國Millipore公司，ECL Plus發光試劑盒、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(5×)、Western及IP細胞裂解液、PMSF、BCA蛋白濃度測定試劑盒購自碧云天公司。

1.2 結腸癌組織與癌旁正常組織中AQP9表達檢測 采用免疫組化IHC法。取結腸癌組織及癌旁正常組織蠟塊，連續切3～5 μm厚切片，每個蠟塊切5張備用。置于65 ℃烘箱中1 h。加入二甲苯脫蠟，無水乙醇脫水，檸檬酸鹽緩沖液中煮沸10 min進行抗原修復，加入內源性過氧化物酶封閉。加入一抗(抗AQP9兔多克隆抗體，稀釋濃度為1∶150)，4 ℃孵育過夜；加入二抗(山羊抗小鼠IgG-HPR)25 ℃孵育1 h。PBS沖洗，DAB顯色，蘇木精復染，梯度乙醇、二甲苯脫水，中性樹脂封片。使用Image-Pro Plus軟件(Msdia Cyber netics, Rockville,MD,USA)隨機選擇3個高倍鏡(×400)視野，對陽性細胞百分比和染色強度進行評分。AQP9主要表達在結腸上皮細胞的細胞膜，染色后呈棕黃色。陽性細胞百分比評分：<10%計1分，10%～50%計2分，50%～80%計3分，>80%計4分；陽性著色強度評分：無色計0分，淡黃色計1分，棕黃色計2分，棕褐色計3分。兩項評分相乘<3為陰性、≥3為陽性。

1.3 AQP9過表達對結腸癌細胞侵襲和遷移能力的影響觀察

1.3.1 細胞培養 HCT116細胞采用含10%的胎牛血清、1×105U/L青霉素、100 mg/L鏈霉素的DMEM高糖培養基培養，常規培養于37 ℃、5% CO2的細胞培養箱中。取對數生長期細胞用于實驗。

1.3.2 細胞分組與轉染 將細胞分為空白組、AQP9過表達組和空質粒組。AQP9過表達組：取對數生長期細胞，按5×104/孔接種于24孔板，37 ℃孵育24 h；當細胞融合度在50%左右時，將0.8 μg過表達AQP9的質粒和2 μL Lipo2000分別溶于50 μL Opti-mem無血清培養基中稀釋，靜置5 min，將兩管溶液混合，放置20 min。將24孔培養板中培養基更換成無血清培養基，每孔400 μL，并將配置的混合溶液加入24孔板中對應位置，6 h后更換成有血清培養基繼續培養24 h。空質粒組：采用pcDNA3.1代替過表達AQP9的質粒，通過Lipo2000轉染至HCT116細胞，步驟與AQP9過表達組相同。空白組正常培養，不進行轉染。

1.3.3 細胞侵襲能力觀察 采用Transwell小室實驗。將Matrigel基質膠加入無血清培養基按1∶4稀釋，取50 μL包被Transwell小室底部膜的上室面，37 ℃靜置4 h，使Matrigel聚合成凝膠。收集各組細胞，加入0.25%胰酶(含EDTA)消化，離心棄培養液，PBS沖洗，用含0.2% BSA的無血清培養液調整細胞密度為5×105/mL。取細胞懸液200 μL加入Transwell小室；下室加入600 μL含10% FBS培養基，37 ℃、5% CO2培養箱培養48 h。取出Transwell小室，PBS沖洗，甲醇固定30 min，0.1%結晶紫染色20 min。擦去上層未遷移的細胞，PBS沖洗。200倍顯微鏡下隨機選擇3個視野，計數穿膜細胞數，結果取平均值。

1.3.4 細胞遷移能力觀察 采用細胞劃痕實驗。收集各組細胞，加入0.25%胰酶(含EDTA)消化，調整細胞密度為1×105/mL，培養過夜。用Marker筆在6孔板背后均勻劃橫線，每隔0.5～1 cm一道，橫穿過孔，每孔穿過3條線。加入細胞約5×105/孔，鋪滿過夜。用槍頭垂直于背后的橫線劃痕，PBS沖洗，加入無血清培養基，37 ℃、5% CO2培養箱培養24 h。于0、24 h取樣、拍照。隨機選取3個標記點，測量24 h時細胞遷移的剩余面積，取平均值。

1.3.5 細胞EMT相關蛋白E-cadherin、Vimentin表達檢測 采用Western blotting法。收集各組細胞，加入裂解液提取總蛋白，用BCA法測定蛋白濃度。取30 μg蛋白上樣，經10%的SDS-PAGE凝膠電泳，電轉移至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉，室溫孵育2 h。加入一抗(Anti-E-cadherin按1∶1 000稀釋、Anti-Vimentin按1∶2 000稀釋)，4 ℃孵育過夜。洗膜，加入二抗(HPR-山羊兔抗IgG按1∶2 000稀釋)，室溫孵育1 h，洗膜。用ECL發光法顯色，Quantity One軟件進行灰度值分析。以GAPDH為參照，計算目的蛋白的相對表達量。

2 結果

2.1 結腸癌及癌旁正常組織中AQP9表達比較 AQP9在結腸癌組織中的陽性表達率為33.33%(11/33)，在癌旁正常組織中的陽性表達率為69.70%(23/33)，AQP9蛋白在結腸癌組織中的陽性表達率低于癌旁正常組織(χ2=8.735，P<0.05)。

2.2 AQP9過表達對結腸癌細胞侵襲和遷移能力的影響

2.2.1 三組細胞侵襲能力比較 AQP9過表達組、空質粒組、空白組的穿膜細胞數分別為(213±19)、(410±30)、(412±30)個，AQP9過表達組穿膜細胞數少于空質粒組和空白組(P均<0.05)。

2.2.2 三組細胞遷移能力比較 AQP9過表達組、空質粒組、空白組24 h細胞遷移剩余面積分別為(27 940±373)、(13 103±499)、(13 723±1 257)μm2，AQP9過表達組細胞遷移剩余面積少于空白組、空質粒組(P均<0.05)。

2.2.3 三組細胞中EMT相關蛋白表達水平比較 AQP9過表達組E-cadherin表達較空白組、空質粒組升高，Vimentin表達較空白組、空質粒組降低(P均<0.05)。見表1。

表1 三組細胞中AQP9、E-cadherin、Vimentin表達水平比較

注：與空白組、空質粒組比較，*P<0.05。

3 討論

結腸癌是常見的惡性腫瘤之一，其發病率和病死率逐年上升。手術是目前治療結腸癌的主要手段，手術切除技術的進步依賴于更新手術的設備和概念，但手術切除的范圍是有限的，據最近一項美國國立癌癥研究所SEER數據庫分析，對于晚期結直腸癌，隨著手術方式的改進對患者的存活率的影響有限，化療方案的進展是CRC患者生存率提高的主要原因[6]。生物治療作為治療結直腸癌等惡性腫瘤的新的治療模式，運用生物技術和生物制劑影響腫瘤的發生、生長、分化、凋亡、侵襲、轉移和復發，促進機體免疫系統重建，從而激發機體對腫瘤細胞的應答，達到控制和消滅體內微小殘留病灶甚至使晚期腫瘤得到部分或完全緩解。生物治療不僅沒有任何不良反應，降低了患者術后復發和轉移的概率，一定程度上提高了患者對放化療的敏感性和耐受性。因此，尋找結腸癌的生物標志物一直是臨床腫瘤學的熱點。

AQP是一種跨膜的膜孔通道蛋白，目前已經在哺乳動物中鑒定出15種水通道蛋白基因，即AQP0～AQP14[7]。AQP9位于15號染色體(15p22)，由6個外顯子和5個內含子組成。AQP9蛋白對水、甘油、尿素以及一些中性小分子通透，參與細胞內外水分子的轉運，被認為與結腸水運動有關[8]。在結腸，AQP9主要分布在腸黏膜的杯狀細胞的細胞膜，參與腸道系統的水代謝活動[9，10]。已經證實，AQP1、AQP5、AQP8與結腸癌有關[11，12]。本研究結果顯示，結腸癌組織中的AQP9陽性表達率低于癌旁組織，且其過表達后細胞侵襲能力、遷移能力較空白組、空質粒組明顯下降，表明AQP9在結腸癌的生長、侵襲以及轉移中同樣起著非常重要的作用。

腫瘤細胞的侵襲和遷移是造成結腸癌難以根治的重要原因。研究認為，腫瘤細胞自身的運動和侵襲能力的增加是通過在轉移的早期階段經歷EMT實現的[13]。EMT是一種上皮細胞轉變為間充質細胞狀態的細胞過程，在此期間，間質細胞標志物Vimentin上調，而上皮細胞標志物E-cadherin下調[14，15]。腫瘤細胞通過EMT過程，使上皮細胞失去細胞極性，失去與基底膜連接的上皮表型，獲得具有較高的遷移與侵襲能力的間質表型[16]。本研究結果顯示，AQP9過表達組E-cadherin表達較空白組、空質粒組升高，Vimentin表達較空白組、空質粒組降低，表明AQP9過表達可誘導E-cadherin表達并抑制Vimentin表達，從而抑制上皮來源的腫瘤細胞向間質細胞表型轉變。由于EMT導致的這種表型的轉變是腫瘤轉移的基礎，其過程被抑制后，轉移能力隨之下降，因此AQP9過表達可抑制結腸癌的侵襲和遷移能力，其機制可能是通過抑制EMT來實現的。

綜上所述，結腸癌組織中AQP9表達降低；AQP9過表達可抑制結腸癌的侵襲和遷移能力，其機制可能是通過抑制EMT來實現的。檢測AQP9的變化可能為早期診斷提供參考，而AQP9相關制劑的研究可能為靶向治療提供新的選擇。