草地貪夜蛾萊氏綠僵菌的分離鑒定

鄭亞強 胡惠芬 付玉飛

摘要 草地貪夜蛾Spodoptera frugiperda （J.E.Smith）是2019年入侵我國的一種遷飛性害蟲，已成為嚴重影響我國玉米生產的重要害蟲。目前國內關于草地貪夜蛾昆蟲病原真菌的研究報道很少。2019年6月，在云南省曲靖市沾益縣安東村玉米田調查發現了被蟲生真菌感染的草地貪夜蛾幼蟲。經室內分離培養，結合形態和ITS序列相似性分析鑒定確認，感染草地貪夜蛾幼蟲病原性真菌為萊氏綠僵菌Metarhizium rileyi，編號為ZYSP190701菌株。調查表明，2019年7月17日田間草地貪夜蛾的萊氏綠僵菌感染率為15.46%±2.52%，8月2日感染率達29.83%±13.71%。用萊氏綠僵菌ZYSP190701菌株1×108個/mL孢子濃度接種草地貪夜蛾3齡幼蟲后第7天時草地貪夜蛾的感染死亡率高達100%。上述結果表明，萊氏綠僵菌ZYSP190701對草地貪夜蛾有良好的生防潛力，具有草地貪夜蛾生防菌劑開發應用的前景。

關鍵詞 草地貪夜蛾; 萊氏綠僵菌; 昆蟲病原真菌; 生防菌劑

中圖分類號： S 435.132 ?文獻標識碼： A ?DOI： 10.16688/j.zwbh.2019399

Abstract Spodoptera frugiperda （J.E.Smith） is an outbreak invasive pest， especially for maize. To date， little information about entomopathogenic fungi of Spodoptera frugiperda is available in China. In this study， fungi infected S.frugiperda larvae were found in Andong village， Zhanyi county， Qujing city， Yunnan province. The fungi were isolated from the infected cadaver of S.frugiperda， and then the species was identified based on the morphological and molecular biology， the virulence of the fungi against the larvae of S.frugiperda was tested. Results showed that this strain was identified as Metarhizium rileyi （No. ZYSP190701）. The infection rate of S.frugiperda was 15.46%±2.52% on 17th， July and 29.83%±13.71% on 2nd， August， respectively. The cumulative mortality of the 3rd instar larvae of S.frugiperda 7 d after immersion inoculation at 1 ×108 conidia/mL was 100%. Our results demonstrated that M.rileyi ZYSP190701 is a promising candidate for S.frugiperda biocontrol in field.

Key words Spodoptera frugiperda; Metarhizium rileyi; entomopathogenic fungi; biological agents

草地貪夜蛾Spodoptera frugiperda （J. E. Smith），又名秋黏蟲，隸屬于鱗翅目Lepidoptera，夜蛾科Noctuidae，是一種原產于美洲熱帶和亞熱帶地區的雜食性害蟲，尤其對玉米的危害較為嚴重[1-3]。自2019年1月在我國云南省普洱市江城縣首次發現草地貪夜蛾入侵以來[4]，該蟲已蔓延至我國的19個省1 000余個縣，嚴重為害我國的玉米等作物[5]。目前對于該蟲的防治主要采用化學防治方法，然而該蟲對農藥的抗性較強，加之農藥殘留對于人畜的安全隱患，使化學農藥防治受到一定制約[6-7]。自該蟲遷入我國以來，在我國科技工作者積極探究下，已發現一些昆蟲天敵對草地貪夜蛾具有較好的生物防控能力[8-10]。然而，國內關于該蟲的病原真菌還鮮有報道。

昆蟲病原真菌（entomopathogenic fungi）是一類能感染昆蟲并在其體表或體內增殖，使昆蟲發病甚至死亡的真菌[11]。因其對環境友好，對害蟲具有持續的控制能力，不易產生抗藥性，被認為是最有可能替代化學農藥的下一代新型生物農藥[11]。目前，在農林業害蟲生物防治中，運用較為廣泛的有球孢白僵菌Beauveria bassiana、綠僵菌Metarhizium spp.和玫煙色棒束孢Isaria fumosorosea，全世界以這些真菌開發和注冊的微生物殺蟲劑有170多種[11-14]。

我國利用蟲生真菌殺蟲劑在防治林業害蟲馬尾松毛蟲Dendrolimus punctatus和糧食作物害蟲亞洲玉米螟Ostrinia furnacalis（Guenée）和蝗蟲等方面取得了重要成效[15]。國外一些研究表明，球孢白僵菌B. bassiana，布氏白僵菌B. brongniartii，金龜子綠僵菌M.anisopliae，萊氏綠僵菌M.rileyi對草地貪夜蛾具有良好的生防潛能[16-18]。而國內，除程東美等[19]報道白僵菌對草地貪夜蛾具有良好的生防潛力外，尚未見其他相關研究報道。

萊氏綠僵菌M.rileyi （Farl.） Kepler，S.A. Rehner & Humber，原名萊氏野村菌Nomuraea rileyi （Farl.） Samson[20]，隸屬子囊菌門Ascomycota，麥角菌科Clavicipitaceae，是一種對鱗翅目幼蟲極具生防潛能的蟲生真菌，在適宜的環境條件下能引起害蟲的病害流行，有效地防治害蟲[21-22]。研究表明，該菌對斜紋夜蛾S.litura、棉鈴蟲Helicoverpa armigera和小菜蛾Plutella xylostella等多種害蟲具有較好的侵染致病力[23-25]。然而，國內尚未見萊氏綠僵菌感染草地貪夜蛾的報道。

本課題組在云南省曲靖市沾益縣玉米種植區調查發現，田間有草地貪夜蛾幼蟲被真菌感染，由此對病原菌進行了分離培養和種類鑒定，為明確該菌株的分類地位和生防潛能，初步測定了該菌株的侵染致病性，擬為開發真菌殺蟲劑綠色防控草地貪夜蛾提供備選菌株和一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 采集地點及調查方法

試驗地點為云南省曲靖市沾益縣安東村玉米種植區。于該玉米種植區選擇5塊玉米田，每塊田5點取樣，每點20株，逐一統計每株玉米上草地貪夜蛾的數量和罹病蟲量，計算僵蟲率。2019年6月28日首次發現該地有罹病草地貪夜蛾蟲體，分別于2019年7月17日和8月2日進行了系統調查。

1.2 菌株的分離培養

將采集到的罹病草地貪夜蛾蟲體置于5 mL無菌EP管中帶回實驗室，采用劃線法，在薩氏（SDAY）培養基[26]（葡萄糖40 g，蛋白胨10 g，酵母浸膏粉10 g，瓊脂20 g，pH自然）上，于（25±1）℃，L∥D=16 h∥8 h， 相對濕度80%的光照培養箱中培養。培養7 d后，將分生孢子轉接到新的培養基上進行純化。純化的菌株采用SDAY斜面培養基保存于4℃冰箱。經形態學初步鑒定，所有分離的菌株形態特征一致，將其視為同一種菌，并命名為ZYSP190701。

1.3 菌株致病性測定

將分離獲得的菌株ZYSP190701接種于PDA培養基，待其產生大量的分生孢子后（約20 d），用無菌解剖刀刮取培養基表面的分生孢子置于0.02%無菌吐溫80（北京索來寶生物有限公司）中，配制成1×108個/mL孢子懸浮液。挑選大小一致、健康的草地貪夜蛾3齡幼蟲，采用浸漬法進行接種。將草地貪夜蛾幼蟲置于孢子懸浮液中浸漬5 s，取出后用滅菌濾紙吸干蟲體表面多余水分。然后將其置于加有玉米葉的12孔細胞培養板中，于25℃、L∥D=16 h∥8 h光照培養箱中飼養。每天定時觀察，并將死亡蟲體在（25±1）℃、 L∥D=16 h∥8 h條件下保濕培養，根據蟲體是否長出目的菌確定各蟲的死亡原因。設置3個重復，每重復20頭蟲。

1.4 菌落形態觀察

將分離并純化的真菌分別接于PDA（馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂18 g，自然pH，蒸餾水1 000 mL）和SDAY培養基上，置于（25±1）℃，L∥D=16 h∥8 h光照培養箱（恒立（中國）實驗室設備科技有限公司，型號RG300）中培養，于3、7和14 d時，分別測定菌落直徑并觀察菌落形態特征。

1.5 基因組DNA提取及rDNAITS的PCR擴增

病原菌DNA的提?。簠⒄贞惣嫉萚27]的Chelex100法進行。使用無菌解剖刀于固體培養基上挑起綠豆大小菌苔于1.5 mL Eppendorf管中，加入液氮稍加研磨。然后加入0.5 mL 10%（m/V）的Chelex100溶液，渦旋器上振蕩5 s，沸水浴10 min，冷卻至室溫后，12 000 r/min離心15 min。取上清液備用。

rDNAITS的PCR擴增：PCR反應體系為25 μL，包括引物ITS1和ITS4各1 μL，PCR mix 12.5 μL，基因組DNA 2 μL，ddH2O 8.5 μL。反應條件：94℃預變性5 min;94℃變性 1 min，57℃退火2 min，72℃延伸 1 min，32個循環;72℃延伸 5 min。1.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測。PCR產物送昆明碩擎生物科技有限公司測序。

1.6 系統發育分析

根據測序結果，將序列進行編輯，去除兩端質量不好的堿基，將優化好的ITS 序列提交到NCBI網站 （http：∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi），運用BLAST程序進行比對。序列經BLAST 后下載相似性大于84%的序列及其相關近緣屬菌株的ITS 序列，用MEGA 6.06 進行序列處理，應用最大似然法（ML），運行1 000 次bootstrap驗證，構建系統發育樹[28]。

2 結果與分析

2.1 田間僵蟲率及室內致病性

2019年6月28日在云南省曲靖市沾益縣安東村玉米種植區首次發現草地貪夜蛾的罹病蟲體，2019年7月17日和8月2日對草地貪夜蛾的僵蟲率進行系統調查，結果表明，7月17日時僵蟲率較低，為15.46%±2.52%。8月2日僵蟲率為29.83%±13.71%（圖1）。在田間，被感染的草地貪夜蛾幼蟲一般附著于玉米葉片上或玉米心葉中，罹病蟲體前期僵硬，蟲體發紅，隨后逐漸長出大量白色菌絲，后期罹病蟲體表面產生大量綠色的孢子粉（圖2a～d）;孢子經室內分離培養后采用浸漬法回接草地貪夜蛾健康幼蟲，接菌后3～7 d草地貪夜蛾幼蟲死亡，其感染癥狀和形態特征與田間感染癥狀一致，說明該菌株為草地貪夜蛾的病原真菌。致病性初步測定結果表明，在1×108個/mL孢子濃度下，接菌后第7天，草地貪夜蛾3齡幼蟲的累積死亡率達100%。

2.2 病原真菌的形態學特征

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（責任編輯： 楊明麗）