嵌合蛋白MoSlp1-AtCERK1作為抗病激發子的研究

陳林梟 馮華峰 吳夢琪

摘要 本研究通過DNA體外重組技術，將稻瘟病菌MoSlp1基因和擬南芥幾丁質寡糖受體基因AtCERK1的跨膜結構域和胞內結構域基因融合，構成嵌合基因MoSlp1-AtCERK1。在煙草瞬時表達試驗中，MoSlp1-AtCERK1嵌合蛋白誘導煙草產生以過敏性壞死為表現形式的過敏反應。以帶有MoSlp1-AtCERK1蛋白的農桿菌注射煙草，可增強煙草對煙草花葉病毒的抗病性。同時提高煙草的PR-1基因轉錄表達水平，表明MoSlp1-AtCERK1嵌合蛋白基因通過水楊酸信號傳導的途徑激活煙草系統獲得性抗病。

關鍵詞 嵌合基因; 抗病激發子; 誘導途徑

中圖分類號： S 435.72 ?文獻標識碼： A ?DOI： 10.16688/j.zwbh.2018424

Abstract In this study， DNA recombination technology was used to fuse the MoSlp1 gene of Magnaporthe oryzae and the transmembrane and intracellular domain of AtCERK1 gene， the chitin elicitor receptor gene of Arabidopsis thaliana， to construct the chimeric gene MoSlp1-AtCERK1 as a disease-resistant elicitor. In tobacco transient expression experiments， MoSlp1-AtCERK1 chimeric protein induced tobacco allergic reactions in the form of allergic necrosis. Inoculation of tobacco with Agrobacterium carrying the MoSlp1-AtCERK1 protein enhanced tobacco resistance to Tobacco mosaic virus and at the same time increased the transcription level of PR-1 gene in tobacco， indicating that the MoSlp1-AtCERK1 chimeric protein activated the tobacco to acquire resistance through the salicylic acid signaling pathway.

Key words chimeric gene; disease-resistant elicitor; induction pathway

煙草花葉病是煙草的主要病害之一，嚴重影響煙草的生長，煙草花葉病毒（TMV）傳染性強，可以在不同植物之間傳播[1]。研究表明[2]，煙草花葉病毒侵染煙草植株后會破壞植株的組織結構，葉片出現斑點，呈現出黃綠相間的不同區域。對煙草花葉病的主要防治手段有農業防治[3]、化學防治[4-6]和生物防治[7-9]。

通過DNA體外重組技術，構建能特異性結合激發子的嵌合受體，是增強植物抗病性的有效方法之一。Kishimoto等[10]發現將水稻的幾丁質寡糖受體OsCEBiP與水稻抗白葉枯病的XA21受體的跨膜結構域和激酶結構域融合所構成的嵌合受體CRXA，在幾丁質殼寡糖處理下，能激活水稻的過敏性壞死和誘導水稻對稻瘟病菌的有效限制。嵌合基因技術作為一種有效的基因重組技術，所構建的嵌合受體在植物抗病方面值得我們重視。通過DNA體外重組技術來增強植物的抗病性，將是一種全新的探索研究。

在水稻與稻瘟病菌親和互作中，稻瘟病菌的菌絲頂端直接插入水稻細胞質中，大量分泌一種具有2個LysM結構域的效應蛋白MoSlp1（secreted LysM protein 1）。MoSlp1蛋白與水稻的幾丁質受體OsCEBiP（chitin elicitor binding protein）競爭性結合幾丁質寡糖，阻礙水稻由幾丁質寡糖所激發的免疫反應[11]。效應蛋白MoSlp1是稻瘟病菌成功侵染水稻所必需的。

擬南芥Arabidopsis thaliana中幾丁質寡糖受體被稱為AtCERK1（chitin elicitor receptor kinase 1），胞外是由1個信號肽和3個LysM結構域所構成，MoSlp1是由1個信號肽和2個LysM結構域構成，同時AtCERK1能夠增強煙草對煙草花葉病毒的抗性[12-13]。通過氨基酸序列比對發現，MoSlp1的2個LysM功能域MoSlp1-LysM1、MoSlp1-LysM2與AtCERK1-LysM2的同源性不高，但與幾丁質寡糖結合處的氨基酸殘基同源性較高[14]。這說明了MoSlp1-LysM1和MoSlp1-LysM2都有可能結合幾丁質寡糖。所以我們以AtCERK1為橋梁，將AtCERK1胞外部分替換為MoSlp1，重組成對幾丁質寡糖超敏感的MoSlp1-AtCERK1嵌合受體，觀察MoSlp1-AtCERK1嵌合蛋白的抗病激發子活性并研究其誘導抗性的途徑。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與儀器

煙草花葉病毒Tobacco mosaic virus（TMV），揚州大學紀兆林教授饋贈; 稻瘟病菌Magnaporthe oryzae（生理小種70-15）來自國家南方農藥創制中心;克隆載體：零背景（pLB）快速連接試劑盒，天根生化科技（北京）有限公司; 表達載體： pHB（雙35S啟動子），本實驗室保存; 原核表達載體： pET-30a（+），美國Novagen生物公司; 真菌RNA提取試劑盒： 北京康為世紀生物科技有限公司; 鎳柱：美國GE醫療器械公司。

為了檢測重組表達的MoSlp1-AtCERK1嵌合蛋白具有蛋白激發子活性，我們選用本氏煙草為研究對象，分別將帶有GFP、AtCERK1和MoSlp1-AtCERK1蛋白的農桿菌注射煙草，48 h后用臺盼藍組織染色法檢測死細胞，試驗重復5次。

為檢測MoSlp1-AtCERK1蛋白誘導煙草抗病所依賴的信號傳導途徑，以250 nmol/L的MoSlp1-AtCERK1蛋白噴霧處理整株煙草，48 h后取少許煙草葉片，提取RNA，反轉錄得cDNA，以EF-1a基因為內參，用熒光定量PCR法測定PR-1、LOX和ERF1的相對表達量，試驗重復3次。本研究中所用引物序列見表1。

2 結果

2.1 MoSlp1-AtCERK1基因構建

如圖1a所示，本研究將MoSlp1基因的終止密碼子除去，再把整個MoSlp1基因與AtCERK1基因的跨膜結構域和胞內激酶結構域相互融合。兩個基因在AtCERK1基因的第229位甘氨酸（Gly）與MoSlp1相融合形成MoSlp1-AtCERK1嵌合基因。之后再用雙酶切法將整個嵌合基因插入到帶有雙重CaMV 35S啟動子和綠色熒光蛋白（GFP）標簽的pHB載體中。

2.2 MoSlp1-AtCERK1蛋白誘導表達

MoSlp1-AtCERK1蛋白誘導利用原核表達系統，在1 mmol/L IPTG誘導作用下，在大腸桿菌中將重組蛋白MoSlp1-AtCERK1成功表達出來。帶有6×His標簽的MoSlp1-AtCERK1蛋白的SDS-PAGE分析見圖2。從圖2 SDS-PAGE 分析可知，在80 kD左右處有單一條帶，MoSlp1-AtCERK1蛋白體外成功表達，為后續試驗提供方便。

2.3 MoSlp1-AtCERK1基因亞細胞定位

從圖3可知，MoSlp1-AtCERK1基因定位于細胞質膜上，這與AtCERK1基因定位一致。這是因為在MoSlp1-AtCERK1基因的氨基酸序列中，AtCERK1基因的跨膜結構域全部被保留，利用跨膜結構域與膜結合的特性將MoSlp1-AtCERK1基因錨定于質膜上。MoSlp1基因的N端含有信號肽，沒有跨膜結構域存在，這是MoSlp1基因定位于細胞核和細胞質中的主要原因。

2.4 MoSlp1-AtCERK1蛋白在煙草中瞬時表達及誘導煙草過敏反應 ?根據pHB載體上的酶切位點，本研究在MoSlp1-AtCERK1 C端插入了GFP標簽，同時構建pHB-AtCERK1，pHB-AtCERK1-ECD，pHB-AtCERK1-ICD和pHB-MoSlp1載體，觀察各個基因編碼的蛋白在煙草中瞬時表達情況，結果見圖4a～b。AtCERK1-GFP（ⅲ）和MoSlp1-AtCERK1-GFP（ⅳ）激發本生煙草的過敏性壞死。由此說明AtCERK1和MoSlp1-AtCERK1蛋白具有類似于蛋白激發子的活性，而MoSlp1-GFP（ⅱ），AtCERK1-ECD-GFP（ⅴ）和AtCERK1-ICD-GFP（ⅵ）沒有產生過敏性壞死現象，所以都不具有蛋白激發子活性。從圖4c～e可知，對照組GFP（c）中有少量的細胞死亡，可能是由于農桿菌侵染導致。而AtCERK1（d）和MoSlp1-AtCERK1（e）蛋白注射煙草后，死亡的細胞明顯增多，表明煙草葉片產生過敏性壞死現象。

2.5 MoSlp1-AtCERK1蛋白誘導煙草對煙草花葉病毒抗性 ?MoSlp1-AtCERK1蛋白誘導煙草對煙草花葉病毒的抗性見圖5。與對照組（a）相比，MoSlp1-AtCERK1（c）誘導的煙草病斑數明顯減少，表明MoSlp1-AtCERK1蛋白可以誘導煙草對TMV抗性。而AtCERK1（b）誘導的煙草對TMV抗性更強，病斑數更少。我們觀察到，煙草花葉病毒的病斑大小與對照組相比，沒有明顯差異，這說明AtCERK1和MoSlp1-AtCERK1蛋白誘導煙草抵御煙草花葉病毒的抗性僅表現為抑制初侵染，而一旦煙草花葉病毒成功入侵煙草后，對其增殖并沒有明顯抑制作用。

2.6 MoSlp1-AtCERK1信號傳導途徑

MoSlp1-AtCERK1蛋白誘導煙草相關防衛基因的表達見圖6。從圖6可知， PR-1a基因相對表達量明顯上升了將近800倍，PR-1b基因相對表達量上升了約15倍。LOX和ERF1基因的相對表達量略有上升（4.5倍和4倍），與PR-1a基因相比可以忽略。由此我們可知，外源MoSlp1-AtCERK1蛋白處理誘導煙草抗病是依賴于SA信號傳導途徑。

3 結論與討論

MoSlp1-AtCERK1基因定位于細胞膜上才能感知在非原生質體間積累的幾丁質寡糖。MoSlp1自身發生同源二聚化或同源共聚化，通過AtCERK1激酶結構域將信號傳遞至胞內激酶結構域中，激活激酶結構域的磷酸化，將信號傳導并放大，誘導植物產生一系列的免疫反應[18]。所以MoSlp1-AtCERK1 基因定位細胞膜上，是MoSlp1-AtCERK1 嵌合受體能誘導植物產生免疫反應的基礎。

Pietraszewska等[16]認為AtCERK1蛋白在煙草中瞬時表達會引起LysM結構域的同源二聚化，激活胞內激酶結構域，從而引起煙草的過敏反應。若將AtCERK1胞內激酶結構域的關鍵位點（第349位的賴氨酸）突變，過敏反應將不會發生。Mentlak等[19]在酵母雙雜交實驗中發現MoSlp1能形成同源二聚體或同源共聚體，但我們的試驗并沒有發現MoSlp1引起過敏性壞死現象。MoSlp1蛋白LysM結構域的存在并發生同源二聚化或同源共聚化是MoSlp1-AtCERK1蛋白誘導煙草產生過敏反應所必需的，而且更進一步說明MoSlp1與AtCERK1-ICD融合構建的嵌合受體具有AtCERK1相似的功能和活性。植物病原菌分泌的Harpin蛋白作為蛋白類激發子在寄主植物上產生致病性，在非寄主植物上可以誘導過敏性壞死，同時可以誘導植物抗病并促進植物生長[18]。我們雖然沒有將MoSlp1-AtCERK1蛋白與Harpin蛋白直接進行對比試驗，但是我們預測融合蛋白MoSlp1-AtCERK1也可能作為一種蛋白類激發子，可以誘導植物的非寄主抗病和促進植物生長。

目前已知的植物抗病信號傳導途徑主要依賴于水楊酸（SA）、乙烯（ET）和茉莉酸（JA）介導的途徑[20]。植物病程相關基因PR-1的誘導表達是植物依賴于水楊酸誘發系統獲得性抗病產生的分子標志[21]。乙烯響應元件綁定因子ERF1基因是乙烯信號傳導過程中的關鍵轉錄因子之一[22]，脂氧合酶基因LOX是茉莉酸合成途徑的關鍵酶編碼基因[23]。所以常將PR-1、ERF1和LOX這3個基因作為水楊酸、乙烯和茉莉酸信號通路的標志性基因。在本文中，PR-1a基因相對表達量明顯上升，說明外源MoSlp1-AtCERK1蛋白處理誘導煙草抗病是依賴于SA信號傳導途徑。

我們通過DNA體外重組技術克隆MoSlp1-AtCERK1基因，在煙草系統中測試了MoSlp1-AtCERK1作為蛋白激發子的各種生理指標試驗，證明MoSlp1-AtCERK1具有蛋白激發子活性，可誘導煙草過敏性細胞壞死反應。同時MoSlp1-AtCERK1蛋白可以誘導煙草對煙草花葉病毒的抗性，此誘導過程依賴于水楊酸信號傳導途徑。

參考文獻

[1] 馬國勝，何博如. 煙草病毒研究現狀與展望[J]. 中國生態農業學報，2006，14（2）：150-153.

[2] 北京農業大學.農業植物病理學[M]. 北京：農業出版社， 1991： 301-302.

[3] 蔡健和， 周興華， 黃福新，等. 廣西煙草病毒病發生相關因素分析及綜合防治研究[J]. 南方農業學報， 2009， 40（2）：159-163.

[4] 李宏光， 鐘權， 張賽， 等. 8種農藥防治煙草花葉病的田間藥效試驗[J].江西農業學報， 2012， 24（4）： 100-101.

[5] 劉旭， 萬宣伍， 劉國軍， 等. 3種藥劑對煙草花葉病的控制作用及農藝性狀的影響[J]. 西南師范大學學報（自然科學版）， 2010， 35（1）： 101-104.

[6] XU Xingyang， OUYANG Jin，YANG Ming. Field observation on control of Tobacco mosaic virus （TMV） with Chemicals [J]. Tobacco Science & Technology， 2017， 50（12）： 90-95.

[7] 申莉莉， 王鳳龍， 錢玉梅. 拮抗細菌對煙草花葉病毒（TMV）的抑制作用研究[J]. 中國煙草科學， 2007， 28（5）： 9-11.

[8] 尤升波， 游銀偉. 草酸青霉菌果膠酶誘導煙草抗TMV的研究[J].山東農業科學， 2014， 46（5）： 102-106.

[9] LIAN Lingli， XIE Liyan， ZHENG Luping， et al. Induction of systemic resistance in tobacco against Tobacco mosaic virus by Bacillus spp.[J].Biocontrol Science & Technology，2011，21（3）：281-292.

[10] KISHIMOTO K， KOUZAI Y， KAKU H， et al. Enhancement of MAMP signaling by chimeric receptors improves disease resistance in plants [J]. Plant Signaling and Behavior，2011，6（3）：449-451.

[11] MENTLAK T A， KOMBRINK A， SHINYA T， et al. Effector-mediated suppression of chitin-triggered immunity by Magnaporthe oryzae is necessary for rice blast disease[J]. Plant Cell， 2012， 24（1）： 322-335.

[12] MIYA A， ALBERT P， SHINYA T， et al. CERK1， a LysM receptor kinase， is essential for chitin elicitor signaling in Arabidopsis [J]. Proceedings of the National Academy of Sciences， 2007， 104（49）： 19613-19618.

[13] ZHAO Xiaoming， SHE Xiaoping， DU Yugang， et al. Induction of antiviral resistance and stimulary effect by oligochitosan in tobacco [J]. Pesticide Biochemistry and Physiology， 2007， 87（1）： 78-84.

[14] LIU Tingting， LIU Zixu， SONG Chuanjun et al. Chitin-induced dimerization activates a plant immune receptor [J]. Science， 2012， 336（6085）： 1160-1164.

[15] HORTON R M， HO S N， PULLEN J K， et al. Gene splicing by overlap extension [J]. Methods in Enzymology， 1993， 217（1）： 270.

[16] 安千里， 楊學健， 董越梅， 等. 用共聚焦激光掃描顯微鏡觀測 GFP 標記的內生固氮菌 Klebsiella oxytoca SA2 侵染水稻根[J]. 植物學報， 2001， 43（6）： 558-564.

[17] PIETRASZEWSKA-BOGIEL A， LEFEBVRE B， KOINI M A， et al. Interaction of Medicago truncatula lysin motif receptor-like kinases， NFP and LYK3， produced in Nicotiana benthamiana induces defence-like responses [J/OL].PLoS ONE，2013，8（6）：e65055.DOI：10.1371/journal.pone.0065055.

[18] ?LI Xiaojie， HAN Bing， XU Manyu， et al. Plant growth enhancement and associated physiological responses are coregulated by ethylene and gibberellin in response to harpin protein Hpa1 [J]. Planta， 2014， 239（4）： 831-846.

[19] MENTLAK A T. Investigating LysM effector function and the biotrophic growth phase of Magnaporthe oryzae[D]. Exeter： University of Exeter，2012.

[20] 汪斌， 李維明. 植物激素的信號轉導系統研究進展[J]. 福建農林大學學報， 2001， 30（4）： 433-438.

[21] UWE C， HERMAN S， KLESSIG D F. Protein dephosphorylation mediates salicylic acid expression of PR-1 genes in tobacco [J]. Plant Journal， 2010， 11（4）： 747-757.

[22] SOLANO R， STEPANOVA A， CHAO Qimin， et al. Nuclear events in ethylene signaling： a transcriptional cascade mediated by ETHYLENE-INSENSITIVE3 and ETHYLENE-RESPONSE-FACTOR1 [J]. Genes & Development， 1998， 12（23）： 3703.

[23] SHI Yanxia， YU Yang， FU Junfan， et al. Relationship between LOX activity and JA accumulations in cucumber leaves induced by pathogen [J]. Acta Phytophylacica Sinica，2008，35（6）：486-490.

（責任編輯： 田 喆）