稻縱卷葉螟成蟲日齡的判定指標

樊茹靜 郭嘉雯 張潔

摘要 本研究旨在明確稻縱卷葉螟成蟲生化和形態指標與其日齡之間的關系，為建立稻縱卷葉螟成蟲日齡判定的數學模型和預測預報提供理論依據。通過提取稻縱卷葉螟成蟲頭部生化物質和解剖其生殖器官，研究了羽化后1～6日齡雌雄成蟲頭部褐脂質、蝶啶含量的變化以及雌蛾卵巢小管和雄蛾精巢的發育狀況。研究表明：（1）不同日齡間雌、雄成蟲頭部褐脂質、蝶啶含量均無顯著差異。（2）不同日齡間雌蛾卵巢小管長度、雄蛾精巢大小均具有顯著差異（P<0.05）。雌蛾1～3日齡、3～6日齡卵巢小管長度與日齡的線性相關系數（R2）分別為0.615 2和0.128 4。雄蛾精巢長半軸、短半軸長度與日齡的線性相關系數（R2）分別為0.578 4和0.579 6。（3）利用卵巢小管長度對低日齡雌蛾日齡的估計表明：1 d估計誤差平均為±0.56 d，2 d估計誤差平均為±0.47 d。利用精巢長半軸對雄蛾日齡的估計表明：1～6 d估計誤差平均為±1.28 d、±1.48 d、±1.43 d、±1.32 d、±1.53 d和±1.29 d。利用精巢短半軸對雄蛾日齡的估計表明：1～6 d估計誤差平均為±1.15 d、±1.04 d、±0.97 d、±1.12 d、±1.46 d和±1.21 d。綜上，頭部褐脂質和蝶啶不能準確反映稻縱卷葉螟成蟲日齡的變化，不能作為其日齡判定的指標。而雌蛾卵巢小管和雄蛾精巢形態穩定，其大小變化與日齡具有一定的對應關系，卵巢小管和精巢在稻縱卷葉螟成蟲日齡的判定中具有較大的應用潛力。

關鍵詞 稻縱卷葉螟; 褐脂質; 蝶啶; 內生殖系統; 日齡

中圖分類號： S 435.112.1 ?文獻標識碼： A ?DOI： 10.16688/j.zwbh.2018390

Abstract This study was carried out to clarify the relations of the age to biochemical and physiological indexes of Cnaphalocrocis medinalis， so as to establish a mathematical model for the determination of the adult age and provide a theoretical basis for the prediction and forecast. The lipofuscin and pteridine were extracted and the internal reproductive organs were dissected to study the lipofuscin and pteridine concentrations and the morphologies of the ovaries and testes in 1-6-day-old moths. The following results were obtained： （1） There were no significant differences in lipofuscin and pteridine concentrations between ages.（2）The length of ovariole of the females and the size of testis of the males had significant differences between ages （P<0.05）. Linear relationships of ovarioles and testes between different ages were also analyzed. The correlation coefficients of ovarioles were 0.615 2 in 1-3 day-old females and 0.128 4 in 3-6 day-old males. The correlation coefficients of the length of testes were 0.578 4 in semi-major axis and 0.579 6 in semi-minor axis.（3）The analysis of age estimation determined by the length of ovarioles showed that the mean errors of estimated age were±0.56 d in 1 day-old females and±0.47 d in 2 day-old. The mean errors of estimated age determined by the semi-major axis length of testes were±1.28 d in 1 day-old males，±1.48 d in 2 day-old，±1.43 d in 3 day-old，±1.32 d in 4 day-old，±1.53 d in 5 day-old and ±1.29 d in 6 day-old. The mean errors of estimated age determined by the semi-minor axis length of testes were±1.15 d in 1 day-old males，±1.04 d in 2 day-old，±0.97 in 3 day-old，±1.12 d in 4 day-old，±1.46 d in 5 day-old and±1.21 d in 6 day-old. It is concluded that lipofuscin and pteridine in the head can not accurately reflect the age of C.medinalis. Stable morphology of female moth ovariole and male moth testis is related to the adult age and has great potential for application in determination of adult age of C. medinalis.

Key words Cnaphalocrocis medinalis; lipofuscin; pteridine; internal reproductive organ; day-age

稻縱卷葉螟Cnaphalocrocis medinalis 為一種可多次夜間飛行和白晝停息的重大農業遷飛性害蟲，飛行過程極為復雜。對其有效防控的前提是及時準確地監測預警。對該類害蟲的監測預警主要依賴異地預測，而異地預測首先要弄清蟲源地所在，這主要借助于軌跡分析，而軌跡分析需明確其具體遷飛次數。王鳳英等[1]、楊帆等[2]先后利用飛行磨裝置在室內條件下測定了稻縱卷葉螟成蟲的再遷飛能力，并提取出飛行的各項行為參數。但田間情況極其復雜多變，稻縱卷葉螟在自然狀態下到底能再遷飛幾次，這個問題尚不得而知。明確稻縱卷葉螟日齡，根據其夜間飛行白晝停息的遷飛特點可有效推測出燈下可見蛾已遷飛多久，即遷飛次數。因此，生產中稻縱卷葉螟遷飛種群監測預警，需要找出明確判定日齡的判斷依據來為其遷飛軌跡分析提供參數。

昆蟲年齡分級的理論基礎是昆蟲在其生長發育過程中必然會發生一系列有規律的變化，其中一些因子可以作為昆蟲年齡的指標，例如體內特定組分（褐脂質和蝶啶）和生殖系統（卵巢和精巢）。

褐脂質，又稱脂褐素、老年色素或蠟樣物，存在于老化細胞。Kodama等指出，褐脂質的年齡估計是相當有效的年齡估計法，在很多具有生態和經濟價值的甲殼動物中得到應用[3]。褐脂質隨年齡的增加在各種昆蟲、甲殼類動物、魚類中均有記載[4-6]。迄今為止只有鄒運鼎等[7]對稻縱卷葉螟成蟲頭部褐脂質和日齡的關系進行過初步研究，但其報道只是簡單提及兩者的關系，且試驗重復量太少，其結果有很大的局限性。因此需重新明確褐脂質和日齡的關系。

蝶啶是嘌呤降解產生的一類生物色素，廣泛存在于昆蟲中。很多研究表明，蝶啶的含量與年齡有關，例如，Mail等[8]發現廄螫蠅Stomoxys calcitrans成蟲頭殼蝶啶含量隨日齡的增長而顯著線性增加，并據此提出了蠅類成蟲日齡推斷的一種生化方法—蝶啶熒光分析法。Rinkevich等[9]采用分光光度計測定蝶啶熒光強度，比較蝶啶濃度、頭重和蜜蜂日齡三者的關系。表明蜜蜂頭部蝶啶含量隨日齡的增長呈線性增長。關于蝶啶和稻縱卷葉螟日齡關系的研究目前未見報道，因此進行本試驗明確兩者的關系以判定昆蟲年齡。

張孝羲等[10]劃分出了稻縱卷葉螟卵巢發育進度分級標準，大體上將稻縱卷葉螟分為5個級別，但其分級標準比較籠統不能精確到日齡。陳慶華等[11]對稻縱卷葉螟1～8日齡精巢長半軸長度進行劃分，明確了精巢長半軸可作為稻縱卷葉螟雄蛾日齡判定指標。但利用該劃分指標推測的估計日齡與實際日齡相差多少，即估計日齡的誤差是多少，陳慶華等未對此部分做研究，因此無法判斷利用精巢長半軸長度估計稻縱卷葉螟日齡的準確性。

因此本研究擬通過稻縱卷葉螟雌雄蛾體內相關組分（褐脂質和蝶啶）含量的變化和生殖系統（卵巢和精巢）的發育狀況來開展該類遷飛害蟲的遷飛日齡判定研究，以找出比較穩定的能反映日齡的指標。確定燈下稻縱卷葉螟成蟲日齡，以期為預測預報提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源

幼蟲參照朱阿秀等[12]的小麥飼養法飼養。具體方法如下：蛹放在鋪有濕潤脫脂棉的塑料盒內（附自制尼龍紗網罩），所有試蟲于恒溫（26±1）℃、RH 80%～90%、光周期L∥D=14 h∥10 h的人工氣候箱（RXZ-380C-LED;寧波江南儀器廠）中飼養繁殖。成蟲以雌雄2×2配對，轉移至500 mL的塑料杯中，定期飼喂5%蜂蜜水。收取1～6日齡雌雄成蟲為供試昆蟲。

1.2 提取體內生化物質

1.2.1 褐脂質

褐脂質的提取參照Robson等[13]和范青松[14]的方法并加以改進如下：取出冷凍的稻縱卷葉螟雌雄成蟲，區分性別后切取頭部并稱重，后轉移至1.5 mL離心管中，每管加入100 μL氯仿-甲醇溶液（2∶1）勻漿，充分勻漿后再加入上述溶液1.4 mL，混勻，然后4 000 g（4℃）離心20 min。取上清液于2 mL離心管中，加入500 μL去離子水，再次離心后取下層溶液待測。用多功能酶標儀以激發光360 nm、發射光450 nm測定熒光強度（整個過程在較暗的環境下進行操作）。以硫酸奎寧為標準物，制作標準曲線并計算每mg頭殼中褐脂質的含量。

1.2.2 蝶啶

蝶啶的提取參照Rinkevich等[9]的方法并加以改進如下：取出冷凍的稻縱卷葉螟成蟲，區分性別后切取頭部并稱重，后轉移至1.5 mL離心管中，進行蝶啶的提取。每管加入1.5 mL氯仿-甲醇溶液（2∶1）勻漿，混勻后超聲波放置15 s讓其溶解，冰上放置>1 min，之后再超聲波溶解15 s，重新放回冰上操作，加入0.75 mL 0.1 mol/L 甘氨酸-氫氧化鈉溶液（pH=10），漩渦10 s，然后5 000 g（4℃）離心5 min。取上清液用于測定蝶啶熒光強度。在發射光450 nm、激發光355 nm的條件下測定熒光強度（蝶啶提取和測定過程均在冰上和較暗的環境下操作）。以硫酸奎寧為標準物，制作標準曲線并計算每mg頭殼中蝶啶的含量。

1.3 解剖內生殖系統

1.3.1 卵巢和精巢解剖

卵巢解剖對蟲體新鮮度要求較高，因此本試驗采用未經冷藏和藥劑處理的新鮮蟲體進行解剖。收取1～6日齡雌蛾，去除翅后將剩余部分固定至含10 mmol/L PBS緩沖液（pH=7.2）的蠟盤中，在顯微鏡下將試蟲腹部朝上，用昆蟲針固定，左手用鑷子固定雌蛾尾部，右手用昆蟲針沿尾部方向劃開腹背交界線，撕開表皮，分離出卵巢。用昆蟲針剔除卵巢周圍的脂肪粒，使卵巢小管清晰可見，以待拍照。雄蛾的精巢解剖方法同卵巢。

1.3.2 拍照測量

采用體視熒光顯微鏡（Nikon SMZ25;日本尼康）拍照，拍照分辨率：4 908×3 264;OBJ：1.0;ZOOM：1.0;MRG總變率：1.0。拍照時將卵巢和精巢輕貼在蠟盤中，避免卵巢小管和精巢出現漂浮現象而造成測量結果不準。拍照保存后，測量卵巢小管長度、精巢長半軸和短半軸長度，各參數都分別測量3次取平均值。

1.4 數據統計與分析

采用SPSS 18.0統計軟件進行試驗數據的統計分析。對不同性別和不同日齡的稻縱卷葉螟頭部褐脂質和蝶啶含量進行雙因子方差分析;對不同日齡雌蛾的卵巢小管、雄蛾的精巢長半軸和短半軸長度之間進行單因子方差分析;對估計日齡和實際日齡的關系進行t檢驗。此外，不同日齡之間用Tukeys HSD檢驗進行處理間差異顯著性檢驗（P<0.05）。

2 結果與分析

2.1 稻縱卷葉螟成蟲頭部褐脂質和蝶啶含量

雙因子方差分析表明，性別（褐脂質：F=0.43， P=0.52;蝶啶：F=0.55， P=0.46）、日齡（褐脂質：F=0.76， P=0.58;蝶啶：F=1.03， P=0.40）及兩者的交互作用（褐脂質：F=0.37， P=0.87; 蝶啶：F=0.40， P=0.85）對稻縱卷葉螟成蟲頭部褐脂質和蝶啶含量均無顯著影響（表1）。

2.2 卵巢小管

2.2.1 稻縱卷葉螟雌蛾各日齡卵巢級別比例

稻縱卷葉螟的卵巢發育共分為5個等級（圖1）。各日齡稻縱卷葉螟卵巢級別所占比例（圖2）為：1日齡的Ⅰ級和Ⅱ級卵巢分別占92.86%、7.14%，2日齡中Ⅰ級和Ⅱ級卵巢分別占10.81%、89.19%，3日齡中Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ級卵巢的占比分別為2.94%、70.59%和26.47%，4日齡中Ⅲ和Ⅳ卵巢分別占73.33%和26.67%，5日齡中Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ級卵巢分別為29.41%、32.35%和38.24%，6日齡中Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ級卵巢分別占比37.5%、6.25%和56.25%。

2.2.2 雌蛾卵巢小管長度及其與日齡的關系

單因子方差分析結果表明，稻縱卷葉螟各日齡間卵巢小管長度具有顯著性差異（F=39.12， df=5，203， P<0.05）。隨著日齡的增加，卵巢小管長度呈現先增后減的變化規律，以3日齡達到最大。1、2、3、6日齡間存在顯著差異，3日齡之后，兩相鄰日齡間卵巢小管長度無顯著差異。對卵巢小管長度與日齡進行線性相關分析（圖3），結果表明，3日齡之前，隨著日齡增加，卵巢小管長度不斷增加，其線性相關系數R2=0.615 2，3日齡之后，隨著日齡增加，卵巢小管長度逐漸減小，其線性相關系數R2=0.128 4。

2.2.3 利用卵巢小管長度和卵巢級別推測的估計日齡與實際日齡相互關系分析 ?結合上述卵巢小管長度和卵巢級別，將1～6日齡進行人為區間劃分：將1日齡和2日齡歸類為低日齡區間;將卵巢級別為Ⅱ級的3日齡歸類為過渡區間;將4日齡、5日齡、6日齡以及卵巢級別為Ⅲ級的3日齡歸類為高日齡區間。

卵巢小管長度隨日齡增長呈先增后減的趨勢，3～6 d的變化與日齡的相關性較差，僅1～3 d隨日齡增加呈顯著線性增長，故利用前3日齡的線性方程判斷低日齡稻縱卷葉螟的年齡。判定方法如下：（1）將卵巢級別為Ⅲ級、Ⅳ級和Ⅴ級的稻縱卷葉螟歸類為高日齡區間，即3日齡（含）之后（3 d之后相鄰日齡間卵巢小管長度無顯著差異，故不進行日齡估計）;（2）將卵巢級別為Ⅰ級和Ⅱ級的稻縱卷葉螟卵巢小管長度帶入線性方程y =2.759 1x+2.683 3中，得出估計日齡，即1、2 d和少數卵巢級別為Ⅱ級的3 d。t檢驗比較估計日齡與實際日齡的顯著性。由于試驗樣本中3日齡只有一頭雌蟲卵巢為Ⅱ級卵巢，無法比較其估計日齡與實際日齡的關系，因此只進行1 d和2 d的比較（圖4）。結果表明1 d估計日齡與實際日齡有顯著差異（t=-6.82， P<0.01），估計誤差平均為±0.56 d。2 d估計日齡與實際日齡無顯著差異（t=0.89， P=0.38>0.01）。估計誤差平均為±0.47 d。

2.3 精巢

2.3.1 雄蛾精巢長、短半軸長度及其與日齡的關系

解剖并測量1～6日齡雄蛾精巢（圖5），單因子方差分析結果表明：隨著生長發育，雄蛾精巢的長、短半軸長度均呈下降趨勢。1、2、5、6日齡之間精巢長半軸長度均具有顯著差異（F=32.88， df=5， 105， P<0.01），而2、3、4日齡之間精巢長半軸長度無顯著差異，精巢長半軸長度與日齡線性相關系數R2=0.578 4（圖6）;1、2、5、6日齡之間精巢短半軸長度也具有顯著差異（F=32.30，df=5，107，P<0.01），2、3、4日齡之間精巢短半軸長度無顯著差異，精巢短半軸長度與日齡線性相關系數R2=0.579 6（圖7）。

2.3.2 利用精巢長半軸長度推測的估計日齡與實際日齡相互關系分析 ?利用精巢長半軸與日齡的線性關系對雄蛾日齡進行估計（圖8），1（P=0.16>0.05）、2（P=0.62>0.05）、3日齡（P=0.16>0.05）雄蛾的估計日齡與實際日齡之間均無顯著差異，估計值比實測值分別小1.28、1.48和1.43 d;而4（P=0.03<0.05）、5（P=0.01<0.05）和6日齡（P=0.01<0.05）雄蛾的估計日齡與實際日齡之間均具有顯著差異，估計誤差分別為1.32、1.53和1.29 d。

2.3.3 利用精巢短半軸長度推測的估計日齡與實際日齡相互關系 ?利用精巢短半軸與日齡的線性關系，對雄蛾日齡進行估計（圖9）。t檢驗表明1（P=0.21>0.05）、2 （P=0.08>0.05）、3 （P=0.10>0.05）和4 日齡（P=0.26>0.05）雄蛾的估計日齡與實際日齡均無顯著差異，估計誤差平均分別為±1.15 d、±1.04 d、±0.97 d和±1.12 d。5 日齡（P=0.008<0.05）和6 日齡（P=0.019<0.05）估計日齡與實際日齡均具有顯著差異，估計誤差平均分別為±1.46 d和±1.21 d。

3 討論

3.1 褐脂質、蝶啶不能準確反映稻縱卷葉螟成蟲日齡變化 ?本文通過比較稻縱卷葉螟雌、雄蛾日齡與褐脂質和蝶啶含量的關系，發現不同性別和日齡的稻縱卷葉螟成蟲頭部褐脂質和蝶啶含量均無顯著性差異。因此褐脂質和蝶啶不能作為判定稻縱卷葉螟成蟲日齡的指標。關于褐脂質與日齡關系的報道，Sohal等的研究表明家蠅Musca domestica[15]頭部褐脂質含量隨家蠅日齡增加而增加。范青松采用組織切片和透射電鏡技術研究口蝦蛄Oratosquilla oratoria腦部褐脂質分布和形態結構特征，建立了褐脂質含量與口蝦蛄[14]年齡相關方程。有些報道表明甲殼類動物體內褐脂質和年齡具有較高的相關性[16-17]。關于蝶啶與日齡關系的報道，采采蠅Glossina morsitans morsitans[18]、 淡足舌蠅G.pallidipes Austen[18]和秋家蠅Musca autumnalis[19]頭殼蝶啶含量隨日齡增加呈顯著線性增長，絲光綠蠅 Lucilia sericata[20]、家蠅Musca domestica[21]蝶啶含量隨日齡增加呈非線性增長，有些蚊類如斯氏按蚊Anopheles stephensi[22]蝶啶含量隨日齡增加呈線性減少。可見不同昆蟲其體內蝶啶含量變化規律不同。昆蟲體內特定組分含量與日齡關系的研究中，主要報道了甲殼類動物和蠅類、蚊類等雙翅目昆蟲，關于鱗翅目昆蟲的報道很少，關于稻縱卷葉螟成蟲日齡與特定組分含量關系的研究更是少之又少?？赡懿煌锓N之間體內特定組分含量變化規律不同，導致了稻縱卷葉螟頭殼褐脂質和蝶啶含量變化規律與已報道雙翅目及其他昆蟲不同。

3.2 卵巢小管作為判斷稻縱卷葉螟雌蛾日齡的指標 ?本研究結果發現，稻縱卷葉螟卵巢級別與卵巢小管長度具有關聯性，這與張孝羲等的報道一致[10]。3日齡之前，卵巢小管逐漸伸長，且變化速率較快，1～3日齡雌蛾的卵巢小管長度有顯著差異，且卵巢小管長度與日齡具有良好的線性關系。而3日齡之后卵巢小管不斷萎縮，但變化過程較慢，相鄰日齡間卵巢小管長度無顯著差異。結合卵巢小管長度變化規律和各日齡卵巢級別所占比例，制定出判定日齡方法。最終能判定出低級別卵巢的稻縱卷葉螟日齡。通過比較1 d和2 d估計日齡與實際日齡的關系表明，1 d平均估計日齡為1.56 d，估計日齡的平均誤差為±0.56 d。2 d平均估計日齡為1.88 d，估計日齡的平均誤差為±0.47 d。卵巢小管作為判斷稻縱卷葉螟雌蛾日齡，具有一定的優勢：對于低日齡區間（3 d之前），能進行有效估計，且估計日齡平均誤差較小，且解剖技術投入成本少、受外來因子干擾小，是一個穩定的檢測指標。卵巢小管長度用于判斷雌蛾日齡，也存在不足：對于高日齡區間（3 d之后）只能大概判斷其日齡范圍。由于卵巢結構復雜，卵巢小管、交配囊等各器官交織在一起，且周圍充斥著脂肪粒，解剖操作難度較大，且費時費力。

3.3 精巢作為判斷稻縱卷葉螟雄蛾日齡的指標

目前關于蛾類雄性生殖系統狀況的判斷主要通過區分射精管的顏色、形態，如斜紋夜蛾Spodoptera litura[23]、二化螟Chilo suppressalis[24]、茶尺蠖Ectropis obliqua[25]。但由于射精管太細且容易變形，其顏色在不同條件下會發生改變，難以形成標準化指標。本文通過解剖稻縱卷葉螟雄蛾，發現雄蛾精巢長、短半軸隨日齡的增加而有規律地顯著減小。陳慶華等[11]以相鄰日齡精巢長半軸的平均值作為兩相鄰日齡的分界點，得到1～8 d稻縱卷葉螟雄蛾日齡的劃分指標，并利用該劃分指標進行1日齡反演。但未對該劃分方法進行驗證，因此無法得知此方法的準確率。與相鄰日齡精巢長半軸平均值劃分指標不同，本文采用精巢長半軸長度和日齡的相關關系式進行日齡估計。雄蛾羽化第1天，精巢長半軸平均值為0.558 8 mm，隨日齡的增加，長半軸逐漸變短，第6天精巢長半軸平均為0.376 mm，比第1天減小了32.7%。陳慶華等的結果為：羽化第1天，精巢長半軸平均值為0.443 3 mm，第6天為0.327 9 mm，比第1天減小了26.03%。雖然與陳慶華的結果略有不同，這可能是地域差異導致，但精巢長半軸變化規律是一致的，均表現為隨著日齡的增加精巢長半軸變短。本文也對精巢短半軸進行了研究，其結果表明，羽化第1天，短半軸平均值為0.504 4 mm，隨日齡的增加，短半軸逐漸變短，第6天精巢短半軸為0.335 1 mm，比第1天減小了33.6%?？梢?，隨日齡的增加，精巢逐日遞減。利用長半軸推測日齡，1～6 d的估計日齡分別為0.47、1.77、2.42、3.11、3.96和5.10 d。利用短半軸推測日齡，1～6 d的估計日齡分別為0.6、2.49、2.55、3.54、4.08和5.28 d。本試驗中，精巢大小隨日齡增加發生相應的變化，精巢大小在一定程度上能反映日齡變化。但利用精巢判定日齡的方法也存在不足：估計日齡均比實際日齡偏低。在接下來的工作中，可通過尋找其他影響精巢大小的因子，選擇同類或近似環境的稻縱卷葉螟進行判定，以便較好地控制判定誤差。

找出明確判定日齡的判斷依據可為遷飛軌跡分析提供參數，從而為預測預報提供理論依據。目前關于稻縱卷葉螟日齡的研究所知甚少，本研究從體內特定組分和生殖系統兩方面進行了研究，明確了褐脂質和蝶啶不能作為稻縱卷葉螟成蟲日齡的判定指標，而生殖系統作為稻縱卷葉螟判定日齡方法，雖有不足之處，但已初步確定卵巢小管長度和精巢長、短半軸與日齡的相關關系，卵巢小管和精巢在稻縱卷葉螟成蟲日齡的判定中具有較大的應用潛力。

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（責任編輯： 田 喆）