大白菜軟腐病拮抗菌的篩選、鑒定及其防效研究

王彪 崔文艷 武君潔

摘要 為篩選對大白菜軟腐病具有較好拮抗效果的生防菌株，采用對峙平板法分別從作物根際土、發酵池以及本實驗室菌種庫得到6株拮抗性較強的菌株ASR-12、ASR-23、ASR-31、ASR-54、ASR-55、ASR-150。在離體葉柄軟腐防效試驗中，采用注射接種法獲得了拮抗性較強的3株拮抗菌ASR-12、ASR-23和ASR-150，48 h的防效分別達到了87.64%、80.90%和70.79%。溫室防效試驗的結果表明：菌株ASR-12、ASR-23和ASR-150防治效果分別為59.22%、59.21%和55.00%，顯著高于72%農用鏈霉素可濕性粉劑的防效（39.15%），具有很好應用前景。依據形態、生理生化和分子鑒定，菌株ASR-12被鑒定為解淀粉芽胞桿菌Bacillus amyloliquefaciens。

關鍵詞 拮抗菌; 篩選; 防效; 鑒定; 解淀粉芽胞桿菌

中圖分類號： S 436.341.13 ?文獻標識碼： A ?DOI： 10.16688/j.zwbh.2018416

Abstract In order to screen the antagonistic strains with good effects on soft rot of Chinese cabbage， a total of 6 strong antagonistic strains， ASR-12， ASR-23， ASR-31， ASR-54， ASR-55 and ASR-150， were isolated from the rhizosphere soil of the crops in the greenhouse， fermentation pool and bacterial bank through confrontation plate culture. Three antagonistic strains， ASR-12， ASR-23 and ASR-150， were selected for soft rot resistance test by petiole injection method of Chinese cabbage in vitro， and their control effects were 87.64%， 80.90% and 70.79%， respectively， in 48 h. The three strains were tested against soft rot in the greenhouse by spraying method， and the results showed that the control effects of the strains ASR-12， ASR-23 and ASR-150 were 59.22%， 59.21% and 55.00%， respectively， significantly better than 72% agricultural streptomycin wettable powders whose effect was 39.15%， indicating they have good application prospect. Based on morphological， physiological and biochemical and molecular identification， the strain ASR-12 was identified as Bacillus amyloliquefaciens.

Key words antagonistic bacteria; screening; control effect; identification; Bacillus amyloliquefaciens

軟腐病是一種世界范圍內的土傳細菌性病害，主要由果膠桿菌屬Pectobacterium細菌引起。我國主要包括胡蘿卜軟腐果膠桿菌胡蘿卜軟腐亞種Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum、胡蘿卜軟腐果膠桿菌黑脛亞種P.carotovorum subsp. atroseptica和菊迪基氏菌Dickeya chrysanthemi等[1-2]。除了危害大白菜以外，這些菌還可以侵染魔芋、胡蘿卜、辣椒、番茄、馬鈴薯及馬蹄蓮等重要經濟作物[1，3-4]，它們在侵染寄主的過程中，能夠產生大量果膠酶，分解寄主植物組織細胞壁，產生臭味，致使寄主組織出現潰爛、浸漬等癥狀，嚴重時可導致整株死亡。

目前，人們主要采取選育抗病品種與化學農藥相結合的方式來防治軟腐病[5]。其中，化學農藥見效快、防效好，但是長期使用不僅會污染環境，還會使病原菌產生耐藥性，使藥效下降。生物防治相較于化學農藥具有選擇性強、環境兼容性好、不易產生耐藥性、生產原料廣泛等優點[6]。隨著現代農業生產的發展，利用環保安全的微生物防治植物病害變得越來越重要。為篩選得到對大白菜軟腐病有較好防治效果的拮抗菌，本試驗以作物根際土、污水池和菌種庫為材料進行篩選， 經室內離體葉柄防效試驗和溫室軟腐病防效試驗進一步驗證，對防效最好的拮抗菌株進行形態、生理生化、16S rDNA和gyrB基因序列分析鑒定，以期為深入開展該菌的生防機理研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

指示菌為軟腐病菌SR-5，保存于本實驗室; 部分待篩菌株取自本實驗室菌種庫。作物根際土和污水分別采集自微生物菌種篩選與應用國家地方聯合工程研究中心溫室大棚和發酵池（昆明安寧市青龍鎮）。大白菜‘83-1（‘魯春白1號）購自云南眾樂農業科技有限公司。72%農用鏈霉素可濕性粉劑購自山東百士威農藥有限公司。培養基為LB固體和LB液體培養基。

1.2 方法

1.2.1 生防菌的初篩

參考熊漢琴的雙培養法[7]并略作修改： 1）取不同作物根際土烘干，稱取5 g加入到45 mL無菌水中，37℃，160 r/min搖床上振蕩培養30 min，用移液槍吸取部分做10倍梯度稀釋; 2）直接取發酵池污水適當稀釋。從-20℃冰箱取出軟腐病菌SR-5于LB固體平板上活化，次日挑取單菌落于LB液體培養基中過夜培養。調整濃度約為107 cfu/mL，分別與帶菌土壤稀釋液和污水稀釋液按1∶1等體積混合，用移液槍吸取200 μL混合液均勻涂布在LB固體平板上，置于37℃恒溫培養箱內培養，24 h后觀察有無抑菌圈產生。挑取有抑菌作用的菌落并連續純化3代以上保存。

同時采用點接法從菌種庫內現有的1 000株菌株中篩選潛在軟腐病生防菌。從-80℃內取出保存在甘油中的菌劃線活化，將200 μL SR-5菌懸液（107 cfu/mL）均勻涂布到LB固體培養基上，用牙簽挑取活化的待測菌株點接在平板上，置于37℃恒溫培養箱內。24 h后觀察有無抑菌圈出現，記錄并保存有良好抑菌作用的菌株。

1.2.2 復篩

用點接法將初篩保存的所有菌株點接到涂布有200 μL SR-5菌株（107 cfu/mL）的LB固體平板上，每個菌株3次重復，培養24 h后采用十字交叉法測量抑菌圈直徑與菌落直徑，計算相對抑制比值。

相對抑制比值=抑菌圈直徑/菌落直徑。

1.2.3 離體葉柄軟腐防效試驗

菌懸液制備： 分別挑取拮抗性較強菌株和指示菌SR-5接種于LB液體培養基內，置于37℃恒溫搖床上培養48 h，采用稀釋涂布法調整菌液濃度，拮抗菌約108 cfu/mL，指示菌約106 cfu/mL。

取健康的白菜葉片，將葉柄剪成大小約3 cm×5 cm的片段，表面用75%乙醇消毒。處理方法參考Zhao等[8]并適當修改，取規格90 mm滅菌培養皿，內鋪兩層滅菌濾紙片，并加適量無菌水保濕，每皿放置1個葉柄片段。設置處理如下： 以接種LB液體培養基的處理為空白對照; 以只接種軟腐病菌SR-5的處理為陰性對照; 接種100 μg/mL氯霉素的處理為化學對照; 接種待選拮抗菌（108 cfu/mL）為處理組。先接種拮抗菌，4 h后再接種軟腐病菌。其中，指示菌SR-5（約106 cfu/mL）與待篩選生防菌（約108 cfu/mL）均采用注射接種法，即使用移液槍將菌液注射入葉柄片段內，每個片段均勻注射3個孔，每孔病原菌與生防菌的接種量均為10 μL。以3個葉柄片段為1個重復，每個處理設置5個重復。培養皿用保鮮膜封口，置于35℃恒溫培養箱內保濕培養。48 h后調查各處理葉片腐爛情況。分級標準如下：0級： 傷口處無軟腐病斑; 1級： 傷口處出現黃褐色水漬狀病斑; 3級： 葉片腐爛面積在10%以下; 5級： 葉片腐爛面積在10%～30%; 7級： 葉片腐爛面積達31%～50%; 9級： 軟腐面積在50%以上。

1.2.4 溫室大棚軟腐防效試驗

試驗于2018年3月-4月在安寧微生物篩選與應用國家與地方聯合工程研究中心溫室大棚進行。菌懸液制備方法同1.2.3。

試驗設計拮抗菌處理、化學藥劑處理（1 000倍72%農用鏈霉素可濕性粉劑），以只接種軟腐病菌SR-5的處理做陰性對照（CK），每處理3個重復，每個重復30株大白菜。在白菜包心初期開始第1次處理，噴施方法及用量參考王超等[9]，在白菜莖基部噴施拮抗菌的菌液（108 cfu/mL），以葉表濕潤且菌液不下流為宜。2 d后開始噴施軟腐病菌（106 cfu/mL），之后每隔7 d噴施1次拮抗菌，共噴施3次，于最后1次處理后7 d調查病情，并計算防效，分級標準參考謝德齡等[10]。

1.2.5 鑒定

1.2.5.1 形態、生理生化鑒定

對菌株ASR-12進行鑒定，以確定其分類地位。測試性狀及方法參考文獻[1]。

1.2.5.2 分子鑒定

參考Cheng等[11]的方法提取細菌基因組DNA。以基因組DNA為模板，使用細菌16S rDNA和gyrB通用引物擴增相應基因片段。其中，反應體系參考熊國如等[12]，擴增程序如下： 94℃ 4 min 30 s;94℃ 30 s，54℃ 40 s，72℃ 1 min 30 s，30個循環;最后72℃延伸10 min。PCR產物送昆明碩擎科技生物有限公司測序。

1.3 統計分析

本試驗中所有數據均利用SPSS 20軟件處理，采用Duncan氏新復極差法進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 篩選結果

分別從作物根際土和污水發酵池中獲得5株和3株對軟腐病菌有抑制作用的拮抗菌，從菌種庫中篩得142株拮抗菌，分別對其進行編號ASR-1至ASR-142（來自菌種庫）、ASR-143至ASR-147（來自作物根際土）、ASR-148至ASR-150（來自發酵池）。

復篩得到6株對軟腐病菌有較強抑制作用的拮抗菌，編號分別為ASR-12、ASR-23、ASR-31、ASR-54和ASR-55、ASR-150。其中ASR-12、ASR-23和ASR-150的抑菌圈直徑分別為11.5、10.33和6.83 mm，它們的抑菌圈直徑與菌落直徑的比值分別達到了2.57、2.22和2.16，其余3株拮抗菌的抑菌圈直徑與菌落直徑比值也都在1.6以上，具體數據見表2，圖1為拮抗菌對軟腐病菌抑制作用效果圖。

2.2 離體葉片軟腐防效

處理48 h后調查發病情況，從圖2和表3來看，只接種病原菌的對照傷口附近出現明顯的水漬狀軟腐病斑，腐爛情況較嚴重，病情指數高達65.93; 空白對照未出現腐爛情況; 化學對照傷口附近幾乎沒有出現軟腐病斑，防效高達96.63%; 拮抗菌ASR-12、ASR-23和ASR-150處理的大白菜傷口附近部分出現腐爛情況，它們的防效分別達到了87.64%、80.90%和70.79%，其中拮抗菌處理ASR-12和ASR-23與化學對照之間差異不顯著。

2.3 溫室大棚軟腐防效

試驗于2018年4月初開始調查，只接病原菌的對照處理發病已比較嚴重，病情指數高達74.07; 農用鏈霉素對照病情指數為45.07，防效僅為39.15%; 拮抗菌ASR-12、ASR-23和ASR-150處理發病較輕，防治效果均顯著優于72%農用鏈霉素可濕性粉劑對照，分別達59.22%、59.21%和55.00%（表4）。

2.4 拮抗菌形態鑒定結果

對菌株ASR-12形態鑒定的結果表明，菌株ASR-12在LB固體培養基上于37℃恒溫培養箱中培養，培養初期菌落乳白色、膿狀、圓形、邊緣整齊，培養后期菌落表面凹陷，表面干燥有褶皺。革蘭氏染色呈陽性，菌體桿狀，產芽胞。

2.5 生理生化鑒定結果

ASR-12的生理生化反應表現為：在2%、5%、7%和10%的鹽濃度下能正常生長，在30、40和55℃下能正常生長，5℃下不能正常生長，過氧化氫、明膠液化、淀粉水解、甲基紅、V.P、產吲哚乙酸、檸檬酸鹽利用等試驗均為陽性，兼性厭氧，不分解尿素。這些特性與解淀粉芽胞桿菌Bacillus amyloliquefaciens相似。

2.6 分子鑒定結果

將菌株ASR-12測序結果利用DNAMAN軟件進行拼接，結果顯示16S rDNA和gyrB基因序列全長分別為1 441 bp和1 201 bp。將拼接結果分別輸入NCBI（https：∥www.ncbi.nlm. nih. gov/）進行BLAST比對，與解淀粉芽胞桿菌的同源性均達到了99%。根據比對結果選取同源性較高菌株序列，利用MEGA 7.0軟件采用鄰接法構建系統發育樹，結果見圖4和圖5。聚類分析將菌株ASR-12鑒定為解淀粉芽胞桿菌B.amyloliquefaciens。

3 討論

近年來，軟腐病已成為制約大白菜等作物高產豐收的主要病害之一。由于化學防治對環境危害很大[13]，不符合綠色農業需求，因此篩選、發掘環境友好型的微生物菌株并開發成相應的產品應用到農業上防治植物病害已成為當前的研究熱點[14-19]。本研究從安寧溫室大棚作物根際土壤、發酵池以及實驗室菌種庫內1 000株菌株中篩選得到6株對軟腐病菌SR-5拮抗性較強的菌株，其中ASR-12， ASR-23及ASR-150的抑菌圈直徑與菌落直徑比值均超過2.1，對軟腐病菌抑制效果優異。室內離體大白菜葉柄組織防效試驗顯示，ASR-12、ASR-23及ASR-150均能有效地抑制葉柄組織中浸漬面積的擴大，且菌株ASR-12的防治效果顯著優于ASR-23與ASR-150，與100 μg/mL氯霉素處理防效相仿。田間試驗顯示，拮抗菌ASR-12處理后軟腐病病情指數下降了43.86百分點，防治效果（59.22%）顯著優于72%鏈霉素可濕性粉劑對照（39.15%）。田間試驗中化學藥劑與生防菌劑對大白菜軟腐病的防控效果低于室內試驗，可能與田間病原菌的濃度與分布、微生物區系及溫濕度、土壤pH、含水量等環境條件因素有關。ASR-12菌株經形態觀察、生理生化及分子手段被鑒定為解淀粉芽胞桿菌B.amyloliquefaciens。芽胞桿菌是最主要的幾種植株根際促生菌（PGPR）之一，具有抗逆性強、對人畜無危害及易于開發為穩定生物制劑等優點，近幾十年來被廣泛開發應用于生物防治領域，能夠較好地防控土傳病害的芽胞桿菌屢見報道[20-22]。

此外，大白菜軟腐病發病迅速，一旦植株出現可見的軟腐病斑，可在短時間內使大白菜品質產量下降甚至整株倒伏死亡。本研究采用先接種生防菌再接種病原菌的方法測定拮抗菌對大白菜軟腐病的預防效果，結果顯示，拮抗菌ASR-12在溫室軟腐防效試驗中的防效為59.22%，明顯優于王超等[9]的48.29%，故在農業生產上對于大白菜軟腐病的防治應該采用“預防為主，治療為輔”的手段，即在軟腐病高發的季節提前噴施生物制劑，以達到預防的目的。對其他生防方式和土傳病害的防控亦有借鑒意義。此外，Hoda等[23]的研究結果表明，將3株拮抗菌Pf2、Bs3和Ra39組合后使用，其防治效果明顯優于三者單獨使用。本試驗篩選得到的3株拮抗菌ASR-12、ASR-23和ASR-150在離體和溫室試驗中均有較好的防治效果，將其組合后使用的防效是否優于單獨使用還有待進一步研究。

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（責任編輯： 田 喆）