5種動物源食品中的氟蟲腈及其3個代謝物殘留量檢測

馮程程 劉新剛 董豐收

摘要 利用QuEChERS技術(shù)結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜的方法檢測5種動物源食品（雞肉、雞蛋、豬肝、牛奶、豬肉）中氟蟲腈及其3個代謝物殘留量。樣品用乙腈提取，經(jīng)低溫處理，多壁碳納米管（MWCNTs）、弗羅里硅土（Florisil）和C18分散固相萃取（d-SPE）凈化，外標法定量。在不同濃度的加標水平下，氟蟲腈及其代謝物在5種動物源食品中的平均回收率為72.1%～113.8%，相對標準偏差RSD為1.9%～17.6%，檢出限LOD在0.73～1.94 μg/kg范圍內(nèi)，定量限LOQ在5～10 μg/kg范圍內(nèi)。該方法具有簡單、靈敏、準確等優(yōu)點，適用于動物源食品中氟蟲腈及其代謝物的快速篩查和定量檢測。

關(guān)鍵詞 農(nóng)藥殘留; 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜; 動物源食品; 氟蟲腈

中圖分類號： S 481.8 ?文獻標識碼： A ?DOI： 10.16688/j.zwbh.2018235

Abstract The QuEChERS technique combined with ultra-high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry was used to detect the residues of fipronil and its three metabolites in five foods of animal origin including chicken， milk， eggs， pork liver and pork. The samples were extracted with acetonitrile， and then experienced low-temperature treatment， d-SPE purification of MWCNTs， Florisil and C18， BEH C18 by using the external standard method. At different concentrations， the average recoveries of fipronil and its metabolites in the five foods were in the range of 72.1%-113.8%， with RSD in the range of 1.9%-17.6%. The LOD was in the range of 0.73-1.94 μg/kg， and LOQ in the range of 5-10 μg/kg. This method is simple， sensitive and accurate. It is suitable for rapid screening and quantitative detection of fipronil and its metabolites in the foods animal origin.

Key words pesticide residue; UPLC-MS/MS; food of animal origin; fipronil

氟蟲腈（fipronil）是世界上首個苯基吡唑類殺蟲劑，由法國Rhone-Poulenc公司開發(fā)[1]，化學(xué)名稱為5-氨基-1-三氟甲基-4-三氟甲基亞磺酰基吡唑-3-腈。分子式為：C12H4Cl2F6N4OS。氟蟲腈主要作用是與γ-氨基丁酸受體（GABA）結(jié)合，抑制氯離子通道，破壞中樞神經(jīng)系統(tǒng)最終達到殺滅昆蟲的目的[2]。由于氟蟲腈是一種化學(xué)性質(zhì)活潑化合物，在其施用后，經(jīng)過水解、光解等作用，會生成3種代謝產(chǎn)物：氟蟲腈砜（MB46136）、氟蟲腈硫醚（MB45950）和氟甲腈（MB46513）。對其代謝物毒性的研究表明：這三者的毒性要高于氟蟲腈原藥[3]。

隨著人們對畜產(chǎn)品肉、蛋、奶等的需求量逐漸增加以及對食品安全的重視程度的不斷提高，國家食品藥品監(jiān)督局和農(nóng)業(yè)部相關(guān)部門對畜產(chǎn)品質(zhì)量也提出了更高的要求。農(nóng)藥殘留易造成飼養(yǎng)環(huán)境污染，威脅畜產(chǎn)品的質(zhì)量安全。因此開發(fā)快速、可靠、高靈敏度的農(nóng)藥殘留檢測技術(shù)是十分重要的。

關(guān)于氟蟲腈殘留檢測最常見的方法是氣相色譜-電子捕獲檢測法（GC-ECD）[4]、液相色譜法（LC）[5]、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）[6]、氣相色譜-質(zhì)譜法（GC-MS）及固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜法（SPME-GC-MS）[7]等。

QuEChERS方法于2003年由Michelangelo等提出[8]。QuEChERS方法具有操作簡單、節(jié)省時間、對環(huán)境污染小、處理步驟少、分析效率高等優(yōu)點，在食品、環(huán)境、生物等多種領(lǐng)域廣泛應(yīng)用，適用于農(nóng)藥多殘留檢測[9-10]。QuEChERS方法還可根據(jù)不同的吸附劑種類匹配不同的樣品基質(zhì)來消除基質(zhì)干擾。最近幾年，不斷涌現(xiàn)出一些新型的吸附劑如碳納米管、生物吸附劑等。其中多壁碳納米管（MWCNTs）因其結(jié)構(gòu)特點為內(nèi)部中空的納米級管，較大的比表面積和表面的疏水基團使其具有較強的吸附和去除色素的能力，被越來越多地應(yīng)用于樣品前處理過程中[11]。

本論文通過對液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜方法以及前處理方法的優(yōu)化，建立了QuEChERS技術(shù)結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測5種動物源食品（雞肉、雞蛋、豬肝、牛奶、豬肉）中氟蟲腈及其3個代謝物的殘留的方法，并將此方法應(yīng)用到來自14個省份的420個樣品的檢測中。通過對檢測結(jié)果進行數(shù)據(jù)分析，為產(chǎn)品的風(fēng)險評估分析提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

無水MgSO4、NaCl，北京北化精細化學(xué)品有限公司;色譜純乙腈，Sigma-Aldrich， Germany;超純水，由Milli-Q超純水儀（Bedford， MA， USA）制備;MWCNTs、florisil、C18、氟甲腈標準品 （99.7%）、氟蟲腈砜標準品（99.7%）、氟蟲腈硫醚標準品（99.7%）由以色列馬克西姆化學(xué)公司提供;0.22 μm濾膜，Agela Technologies，天津;超高效液相色譜串聯(lián)四級桿質(zhì)譜聯(lián)用儀（Acquity UPLC-TQD），Waters公司;KQ-超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司;Milli-Q超純水儀，美國Merck-Millipore公司;X1R高速冷凍離心機，美國Thermo公司;氮吹儀，北京八方世紀科技有限公司。

1.2 樣品前處理方法

用萬分之一天平稱取氟蟲腈（99.7%）、氟甲腈（99.7%）、氟蟲腈硫醚（99.7%）和氟蟲腈砜（99.7%）標準品各0.100 3 g，以色譜純乙腈作為溶劑定容到100 mL，配制濃度為100 mg/L母液，轉(zhuǎn)入棕色瓶置于-4℃冰箱保存。同時采用梯度稀釋法配制0.5、1、2、10 mg/L和20 mg/L的系列標準溶液。

準確稱取雞肉、雞蛋、牛奶、豬肉和豬肝各5.0 g樣品（精確至0.1 g）于50 mL聚四氟乙烯離心管中，分別加入0.1 mL濃度為1、2和20 mg/L（牛奶、雞蛋、豬肝）或0.5、1和10 mg/L（雞肉和豬肉）的標準溶液，然后加入10 mL乙腈作為提取液，渦旋振蕩1 min，室溫下靜置30 min。然后加入3 g NaCl 和2 g 無水MgSO4，渦旋振蕩10 min， 以4 000 r/min離心3 min，取上清液1 mL，置于裝有凈化劑[50 mg florisil（C18）和150 mg無水MgSO4或10 mg MWCNTs （MW<8 nm）]的5 mL離心管，渦旋3 min，以4 000 r/min離心3 min。用無菌注射器抽取上清液，置于離心管中，過0.22 μm有機濾膜于進樣小瓶中，用于進樣。

1.3 液相色譜質(zhì)譜條件

超高效液相色譜的構(gòu)成為：具有色譜柱的加熱器、樣品管理器和雙通道溶劑管理器。Waters UPLC 色譜柱（Acquity BEH C18色譜柱 1.7 μm，2.1 mm×100 mm），柱溫控制在45℃，流動相為乙腈和水。流速0.3 mL/min，進樣量為5 μL。

三重四級桿質(zhì)譜儀配備的是電噴霧離子源，采用負離子ESI-模式;MRM多反應(yīng)離子檢測模式，去溶劑氣和錐孔氣都是高純氮氣，毛細管電壓為3.0 KV;去溶劑溫度為350℃。

1.4 標準曲線、準確度和精密度

稱取一定量的氟蟲腈及其3個代謝物標準品，用乙腈配置成1 000 mg/L的標準儲備液，并依次稀釋成1 000.0、500.0、100.0、50.0、10.0、5.0 μg/L的標準工作溶液，按1.2和1.3的條件進行分析，外標法定量，以氟蟲腈及其3個代謝物的峰面積（y）為縱坐標，質(zhì)量濃度（x）為橫坐標，繪制標準曲線。

在5～200 μg/kg范圍內(nèi)分別對氟蟲腈及其3個代謝物進行3個濃度的添加回收試驗，牛奶、雞蛋和豬肝的添加濃度分別為10、20與200 μg/kg，雞肉和豬肉分別為5、10和100 μg/kg。且每個添加水平重復(fù)5次，用相對標準偏差來驗證方法的精密度（RSD）。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測條件的優(yōu)化

氟蟲腈在高效液相串聯(lián)質(zhì)譜上正負離子模式結(jié)果表明：氟蟲腈及其3個代謝物在ESI-模式和合適的錐孔電壓和碰撞能量下具有明顯的特征離子峰[M-H]-，選擇2個碎片離子峰度和碎片離子數(shù)量都較大的離子作為定性離子和定量離子。調(diào)節(jié)碰撞能量，獲得進一步優(yōu)化的質(zhì)譜參數(shù)（表1）。

2.2 凈化劑的選擇

因動物源食品基質(zhì)復(fù)雜，提取液中含有較多的脂肪和其他的復(fù)雜基質(zhì)，如果直接進樣，可能會導(dǎo)致色譜柱中殘留比較多的脂肪和雜質(zhì)，影響色譜柱的壽命，從而導(dǎo)致其分離效率的降低。再者，質(zhì)譜部件的錐孔處容易堆積部分脂肪和雜質(zhì)，致使儀器的靈敏度下降，重復(fù)性降低。C18對去除樣品中非極性物質(zhì)和中等極性物質(zhì)有良好的作用[12]，而弗羅里硅土（florisil）主要是用來去除樣品中油脂類物質(zhì)[13]，多壁碳納米管一般不成束，具有不同大小和尺寸的孔徑結(jié)構(gòu)，碳納米管的中空納米結(jié)構(gòu)及較大的比表面積使其具有較多的吸附位點和較強的吸附力[14]。因此本研究中考察了弗羅里硅土（florisil）、C18和多壁碳納米管（MWCNTs）3種凈化劑對其凈化的效果。

各種凈化劑在5種動物源食品中的凈化效果如圖2所示，當雞肉和雞蛋選擇弗羅里硅土，豬肉、牛奶和豬肝選擇MWCNTs時能夠很好地祛除提取液中的雜質(zhì)并能取得比較好的凈化效果。

2.3 分析方法的線性和基質(zhì)效應(yīng)

2.3.1 分析方法的線性

結(jié)果表明：氟蟲腈及其3個代謝物在5～1 000 μg/L范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。氟蟲腈的線性方程：y=33.392x+1 159.1，R2=0.993 3;氟甲腈的線性方程為：y=28.584x+1 138.7，R2=0.990 8;氟蟲腈硫醚的線性方程為：y=26.096x+756.88，R2=0.991 1;氟蟲腈砜的線性方程為：y=63.57x+1 405.6，R2=0.995 1。

2.3.2 基質(zhì)效應(yīng)

分別對豬肉、雞蛋、雞肉、牛奶和豬肝空白基質(zhì)進行樣品前處理，得到空白基質(zhì)溶液。用空白基質(zhì)溶液和乙腈分別配制濃度為10、20、50、100、200和1 000 μg/L的系列基質(zhì)標準溶液和溶劑標準溶液，以色譜峰面積為縱坐標（y），對濃度（x）繪制做出基質(zhì)標準曲線和溶劑標準曲線。按如下公式計算基質(zhì)效應(yīng)：ME%=（B-A）/B×100%，其中B為溶液標準曲線的斜率，A為基質(zhì)標準曲線的斜率。當ME%<0時，為基質(zhì)的增強效應(yīng)，當ME%>0時，為基質(zhì)的抑制效應(yīng)[15]。結(jié)果見表2，表明化合物對動物基質(zhì)均有較大的基質(zhì)效應(yīng)，為保證檢測結(jié)果的真實性，樣品分析采用基質(zhì)標準溶液校正。

2.4 分析方法的準確度、精密度及靈敏度

2.4.1 分析方法的準確度和精密度

氟蟲腈及其3個主要代謝物在5種動物源食品中的平均回收率為72.1%～113.8%，相對標準偏差RSD為1.9%～17.6%。結(jié)果符合農(nóng)藥殘留的標準（表3）。添加回收試驗和空白樣品的色譜圖見圖3。

2.4.2 分析方法的靈敏度

用空白樣品制取濃度依次為10、20、50、100和200 μg/L的基質(zhì)加標樣品。基于UPLC-MS/MS條件，各化合物的定量離子均能在信噪比的10倍以上，該方法的靈敏度用噪音信號的3倍來表示，得出最低檢測限濃度LOD為0.73～1.94 μg/kg，定量限LOQ為5～10 μg/kg。國際食品法典委員會（CAC）規(guī)定：氟蟲腈及其代謝物在牛奶、豬肝和雞蛋中的限量值為0.02 mg/kg，在雞肉和豬肉的限量值為0.01 mg/kg。表4中匯總了線性方程、決定系數(shù)、線性范圍及檢出限。氟蟲腈及其代謝物在10～200 μg/kg質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，決定系數(shù)（R2）大于0.990 1。

3 方法的應(yīng)用

試驗所用的樣品來自河南、北京、新疆、山東、內(nèi)蒙古、四川、浙江、江蘇、寧夏、海南、河北、湖北、云南、黑龍江和廣州14個省份共420個樣品。對這420個動物源食品進行前處理后用于氟蟲腈殘留分析。從氟蟲腈檢測結(jié)果（表5）看出，在所有檢測的動物源食品中，都沒有檢出氟蟲腈。

4 結(jié)論

本文建立了QuEChERS技術(shù)結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測5種動物源食品中氟蟲腈及其3個代謝物殘留的分析方法。氟蟲腈及3個代謝產(chǎn)物在5～1 000 μg/L范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，氟蟲腈的線性方程：y=33.392x+1 159.1，R2=0.993 3;氟甲腈的線性方程為：y=28.584x+1 138.7，R2=0.990 8;氟蟲腈硫醚的線性方程為：y=26.096x+756.88，R2=0.991 1;氟蟲腈砜的線性方程為：y=63.57x+1 405.6，R2=0.995 1。氟蟲腈及其代謝物在5種動物源食品中的平均回收率為72.1%～113.8%，相對標準偏差RSD為1.9%～17.6%，最低檢測濃度LOQ為5～10 μg/kg。結(jié)果表明方法的靈敏度和精確度均符合實際樣品的檢測要求。可用作動物源食品中氟蟲腈及其代謝物的殘留檢測。

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（責(zé)任編輯： 田 喆）