花生新黑地珠蚧發生為害及其系統發育

李紹建 王娜 崔小偉

摘要 本文以花生地下害蟲花生新黑地珠蚧為研究對象，對其田間危害及蟲體發育情況進行了調查，并利用分子生物學技術對其進行系統發育研究。田間調查結果表明，花生新黑地珠蚧在河南省一年發生一代，多發生于沙壤土，主要以珠體狀的2齡若蟲為害花生根部;雌雄珠體數量及大小差異均較大，單株花生上為害的雌珠體數17～78頭，雄珠體數59～146頭，雌雄珠體性比為1.00∶2.61，雌雄珠體直徑分別為4.72～7.26 mm和1.83～2.65 mm。通過系統發育分析和傳統形態學分類的綜合分析表明本研究中所采集害蟲為花生新黑地珠蚧，隸屬于半翅目蚧總科珠蚧科。

關鍵詞 花生新黑地珠蚧; 田間為害; 蟲體發育; 系統發育分析; 珠蚧科

中圖分類號： S 435.652 ?文獻標識碼： A ?DOI： 10.16688/j.zwbh.2018400

Abstract This study aims to investigate the field hazard and development of Neomargarodes gossypii， and reconstruct the phylogenetic relationship among different families. Field survey indicated that N.gossypii occurred one generation per year in Henan province which fed on the roots of peanut by its pearl shaped 2nd-instar nymph， and preferred sandy soil habitats. There were large differences on the amount and size between female and male pearl. The amount of female and male pearl per peanut was 17～78 and 59～146， respectively and the sex ratio was 1.00∶2.61. The diameters of female and male pearl were 4.72～7.26 mm and 1.83～2.65 mm， respectively. Through comprehensive analysis of phylogenetic tree and morphological classification， the samples collected in Henan peanut fields were identified as N.gossypii that belongs to Margarodidae （Hemiptera： Coccoidea）.

Key words Neomargarodes gossypii; field hazard; development; phylogenetic analysis; Margarodidae

花生新黑地珠蚧Neomargarodes gossypii Yang，屬半翅目Hemiptera蚧總科Coccoidea珠蚧科Margarodidae[1]，在我國華中、華東、華北及西北地區均有發生，是一種嚴重為害花生的地下害蟲[2-5]。該蟲主要以2齡若蟲聚集在花生根部刺吸根系汁液為害，導致根系衰弱，側根減少，進而花生生長不良，結果少而癟或不結果，嚴重影響花生產量和品質[6]。據調查，一般田塊可造成花生減產20%～30%，嚴重田塊可達50%以上，甚至絕收[7]。近年來，花生新黑地珠蚧的為害越來越嚴重，已成為制約我國花生產業發展的重大阻礙。

新黑地珠蚧又名烏黑新珠蚧，其最早于1912年由英國學者Green作為新種以Margarodes niger的拉丁學名發表，并將其歸類至珠蚧屬Margarodes下，1928年Morrison將該蟲歸類至新珠蚧屬Neomargarodes下，并沿用拉丁文種名niger[8]。我國學者侯璋德等首次將為害我國花生的珠蚧定為烏黑新珠蚧Neomargarodes niger （Green）[9]，隨后此名稱被多名學者沿用。1979年，楊集昆先生通過對各地為害花生的新珠蚧標本進行對比鑒定，確定為害我國棉花、豆類等作物的新珠蚧是新種，應為棉根新珠蚧Neomargarodes gossypii Yang，隨后的研究發現，該珠蚧主要為害豆科植物且能完成生活史，卻不能在棉花上完成生活史，因此建議將其中文名改為花生新珠蚧[1]。目前，國內學者習慣將其稱之為花生新黑地珠蚧[4-5]。

截至目前，國內學者對花生新黑地珠蚧的研究相對較少，且主要集中于對其生物學特性及防治方法的研究，未見其系統發育的相關報道，國外更是鮮有關于花生新黑地珠蚧的相關研究。為了更好地了解花生新黑地珠蚧的發生為害及其系統發育，我們對其田間危害及蟲體發育情況進行了調查并利用分子生物學技術對其進行系統發育分析，現將結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 田間調查

選取有花生新黑地珠蚧發生的田塊，調查其為害花生的癥狀及花生受害情況，同時定期調查花生各發育期及收獲期后田間花生新黑地珠蚧的發生發展情況。

1.2 樣本采集

于田間花生新黑地珠蚧高發期，在河南省開封市和濮陽市分別選取受害嚴重的地塊采集花生新黑地珠蚧珠體，分地域標記記錄后帶回室內。

1.3 花生新黑地珠蚧基因組DNA提取

將田間采集的花生新黑地珠蚧珠體放入玻璃培養皿中，置于28℃的恒溫培養箱中避光培養，15 d左右后雌珠體可羽化出成蟲; 收集單頭雌成蟲于滅菌1.5 mL PE離心管內，每管加入3 μL STE （0.1 mol/L NaCl; 10 mmol/L Tris-Cl，pH 8.0; 1 mmol/L EDTA，pH 8.0）裂解液及滅菌小玻璃珠若干，于Bullet Blender STORM研磨儀（Next Advance）上研磨至勻漿，每管補足裂解液至30 μL并加入0.2～0.3 μL蛋白酶K，56℃恒溫水浴裂解2～3 h，然后95℃水浴10 min滅活蛋白酶K，短暫離心，吸取每管內DNA溶液于新的滅菌1.5 mL PE離心管，分別標記后置于-20℃冰箱保存備用。

1.4 花生新黑地珠蚧序列擴增及測定

花生新黑地珠蚧的序列擴增選取核糖體小亞基（18S）基因[10]、核糖體大亞基（28S）基因的D2和D10擴展區域[11-12]以及蛋白編碼延伸因子1α（EF-1α）基因[13]，各序列擴增引物信息見表1。

PCR反應體系為25 μL，其中2×Taq PCR Master Mix 12 μL，ddH2O 10 μL，上、下游引物各1 μL（10 μmol/L），模板DNA 1 μL。擴增程序為： 94℃預變性4 min; 94℃變性45 s，57℃（18S）/56℃（28S-D2）/62℃（28S-D10）/55℃（EF-1α）退火30 s，72℃ 延伸1 min，30個循環; 72℃延伸5 min，4℃保存。取4 μL PCR擴增產物，在1%瓊脂糖凝膠上電泳檢測，將含有目的片段的PCR擴增產物送生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。

2 結果與分析

2.1 花生新黑地珠蚧田間為害

花生新黑地珠蚧喜干燥疏松的沙土或沙壤土，在黃壤土、黏壤土中發生較輕或不發生。該蟲主要以1～2齡若蟲聚集在花生根部，大量刺吸花生汁液，造成花生主根發黑，側根減少，甚至腐爛，植株嚴重矮化，葉片自下而上褪綠發黃甚至整株花生干枯死亡，花生結果少而癟，甚至不結果。將受害花生植株連根拔起，可見大量2齡珠體吸附于根部，花生新黑地珠蚧在田間常成片發生，且為害嚴重（圖1a，圖1b）。

2.2 花生新黑地珠蚧蟲體發育循環

通過對花生新黑地珠蚧在花生各發育期及收獲期后的定期調查發現，花生新黑地珠蚧在河南省各發生地區均1年發生1代，以2齡若蟲在花生主根層土壤中越冬，2齡若蟲珠體狀，分深褐色和黑色兩種：大的為雌性，小的為雄性。4月初至5月下旬，2齡雄珠體先蛻殼變為3齡若蟲，然后變為前蛹，再變為蛹，4月底至6月上旬蛹羽化變為雄成蟲爬出地面。2齡雌珠體于4月底至6月初蛻殼變為雌成蟲，爬上地面與雄成蟲交配產卵。5月中下旬至6月中下旬，卵孵化成為1齡若蟲，1齡若蟲部分爬出地面尋找花生寄主，部分直接在土壤中尋找花生根部，進而取食花生根部汁液，于7月上旬至8月下旬發育為大小不同的雌雄2齡珠體，聚集吸附在花生根部為害（圖1a，圖2）。

花生新黑地珠蚧雌成蟲交配后即爬回地下產卵，卵塊多分布于距地表10 cm左右，每個卵塊中卵粒數從110粒到1 058粒不等，單株花生根上為害的花生新黑地珠蚧雌珠體數17～78頭，雄珠體數59～146頭，花生新黑地珠蚧卵及珠體數量詳見表2。同一株花生根部為害的花生新黑地珠蚧雄珠體數量明顯多于雌珠體數量，雌雄性比平均為1.00∶2.61。2齡雌雄珠體大小相差較大，雌珠體直徑4.72～7.26 mm，平均6.27 mm，雄珠體直徑1.83～2.65 mm，平均2.30 mm（表3）。

2.3 花生新黑地珠蚧系統發育

本研究中所測河南省開封（KF）和濮陽（PY）的花生新黑地珠蚧18S、28S-D2、28S-D10和EF-1α基因序列分別上傳到GenBank數據庫并獲得登錄號：開封的花生新黑地珠蚧18S、28S-D2、28S-D10和EF-1α的GenBank登錄號分別為MH051908、MH133216、MH133218和MH230870; 濮陽的花生新黑地珠蚧18S、28S-D2、28S-D10和EF-1α的GenBank登錄號分別為MH051909、MH133217、MH133219和MH230871。

為更加準確地分析花生新黑地珠蚧的系統發育，將所測得的兩個地區花生新黑地珠蚧的18S、28S-D2、28S-D10和EF-1α的序列分別用Geneious軟件（11.1.4）進行串接。同時，利用GenBank數據庫中蚧總科內其他科屬的串接序列，以粉蚧科Pseudococcidae為外群，利用MEGA 6.0軟件[14]，采用Kimura 2-parameter距離模型[15]，鄰接法（neighbor-joining）構建系統發育樹，系統樹各分支置信度（bootstrap）均進行1 000次重復檢驗（圖3），構建系統發育樹的其他不同物種序列GenBank登錄信息見表4。從圖3的系統發育樹可以看出，采自河南省開封（KF）和濮陽（PY）的兩個珠蚧種群與紅珠蚧Eumargarodes laingi聚為一支（bootstrap值=1 000），同屬于珠蚧科Margarodidae。

3 結論與討論

本研究通過對花生新黑地珠蚧的田間發生為害調查，已基本摸清該蟲在田間的為害時期、為害特征、蟲體發育循環等特性。花生新黑地珠蚧主要在河南省境內黃河故道及黃泛區區域內的沙土及沙壤土中發生為害，這與馬鐵山等關于花生新黑地珠蚧主要發生在沙質土壤，在黏土和壤土中未見有發生的調查結果一致[16]。花生新黑地珠蚧雌成蟲需鉆入土中產卵，卵孵化出的1齡若蟲需鉆出地面找尋花生寄主并鉆入地下取食為害花生根部，沙土或沙壤土土質疏松的特性有利于花生新黑地珠蚧成蟲和若蟲的活動和入土。本研究前期調查發現，開封地區花生新黑地珠蚧各蟲態發育時期均比濮陽地區花生新黑地珠蚧的各蟲態發育時期稍早，如開封地區4月底5月初花生新黑地珠蚧2齡雌珠體即蛻殼為雌成蟲爬上地表，而濮陽地區這一時間則要稍錯后至5月中下旬，由于濮陽地處豫北，我們推測可能是由于地域上的南北溫度差異造成開封地區蟲體發育的提前，這一推測與馬鐵山等對濮陽地區花生新黑地珠蚧生物學特性的研究及馬鐵山對不同溫度條件下花生新黑地珠蚧發育歷期的影響結果是一致的[6， 16]。

本研究中，根據所采集的珠體及卵塊的形態特征，田間初步認定為珠蚧科昆蟲。結合武三安先生對于花生新黑地珠蚧的形態特征描述[1]，我們在室內利用分子生物學方法對其進行了系統發育分析，綜合分析后確定本文研究對象確為花生新黑地珠蚧，系統進化分析結果與傳統形態學分類結果相互佐證并保持一致。

近年來，花生新黑地珠蚧在河南省的發生越來越嚴重，其整個發育過程中大部分時間均生活在地下，這給生產上采用化學藥劑防治提出了很大挑戰。本研究中對花生新黑地珠蚧蟲體發育的研究表明，其卵孵化為1齡若蟲后需爬回地表進行寄主搜尋，這一時期在地表活動的1齡若蟲易接觸藥劑，因此可作為花生新黑地珠蚧的防治適期，此時期可選用適宜藥劑進行噴霧并輔以花生根部噴淋進行防治。

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（責任編輯： 楊明麗）