九葉青花椒根結線蟲病的病原鑒定

曹業凡 汪來發 王曦茁

摘要 為確定四川省蓬溪縣九葉青花椒種植區發病植株花椒根結線蟲的種類，進而為九葉青花椒根結線蟲病防治提供依據，本文根據根結線蟲雌蟲與2齡幼蟲的形態特征及雌成蟲的會陰花紋、雌蟲酯酶同工酶圖譜，并結合特異性擴增及rDNA-ITS擴增，根據ITS序列構建系統發育樹，對該地區九葉青花椒根結線蟲病的病原進行了種類鑒定。結果表明該病原為南方根結線蟲Meloidogyne incognita （Kofold & White） Chitwood。這是我國首次在九葉青花椒上發現南方根結線蟲。

關鍵詞 九葉青花椒; 南方根結線蟲; rDNA-ITS

中圖分類號： S 435.73， S 432.45 ?文獻標識碼： A ?DOI： 10.16688/j.zwbh.2018402

Abstract In order to confirm the species of root-knot nematode on Zanthoxylum armatum var. novemfolius in Pengxi County， Sichuan province and provide the reference for prevention and controlling with root-knot disease， the nematode was identified by morphological observation， biochemical observation， specific amplification and rDNA-ITS sequence analysis. The results showed that the root-knot nematode on Z.armatum var. novemfolius was Meloidogyne incognita （Kofold & White） Chitwood. This is the first report of M.incognita on Z.armatum var. novemfolius in China.

Key words Zanthoxylum armatum var. novemfolius; Meloidogyne incognita; rDNA-ITS

九葉青花椒Zanthoxylum armatum DC.var. novemfolius Hong Ping Deng隸屬蕓香科Rutaceae花椒屬Zanthoxylum，為竹葉花椒Z.armatum一變種。九葉青花椒起源于重慶江津區，目前在重慶、四川及貴州等省市有廣泛栽培[1]。九葉青花椒與其他花椒種類Zanthoxylum spp.相比，具有花序多、花期較早，果實產量大、品質好等優勢[2]，因此成為當地主要經濟作物，并逐漸成為四川、重慶等省區退耕還林的首選樹種[3]。隨著九葉青花椒種植的集約化與樹齡的增長，各大九葉青花椒產區的花椒病蟲害開始暴發，如銹病、黑脛病、流膠病、煤污病等[4-5]。近幾年來，在四川省遂寧市蓬溪縣及周邊地區，發現九葉青花椒感染根結線蟲，致使九葉青花椒生長不良，產量下降，感病嚴重的地塊，20%～30%的九葉青花椒樹死亡。為鑒定四川蓬溪縣九葉青花椒根結線蟲病害病原，2016年5月至8月間，對蓬溪縣寶梵鎮和新星鄉等鄉鎮的九葉青花椒產地進行病害調查，并采集發病嚴重的九葉青花椒上的根結線蟲樣品帶回室內進行純化培養，結合形態學特征、生物化學特征與分子生物學特征進行分析和鑒定，以期為九葉青花椒根結線蟲病害的綜合防治奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 樣本采集與病害調查

在四川省寶梵鎮和新星鄉九葉青花椒種植區采集感病花椒樣品，使用隨機取樣法，對感病植株根部及其周圍的病土進行采取，取樣深度為表層土10～30 cm，各樣地隨機設置5個采樣點，完成采樣后將樣品混勻放入同一個采集袋內并標記樣品。將采集的標樣帶回實驗室，在顯微鏡下挑取單卵塊。將易感病品種‘918粉紅種植于滅菌培養土中，待長出兩片真葉時，將卵塊接種于培養土中，培養60 d后進行病原鑒定[6]。

1.2 花椒根結線蟲的獲得

雌蟲的分離與收集：經單卵塊接種后的番茄苗培養60 d后，取感染線蟲的番茄根用清水洗凈，在體視顯微鏡下用鑷子或解剖針針尖將根結表皮輕輕挑開，剖面出現的乳白色的光滑梨形物即為根結線蟲的雌蟲，用解剖針輕輕撥出，放入水中待用。

2齡幼蟲的收集：室內單卵塊繁殖60 d后，將番茄病根帶回室內清洗并剪成1～3 cm的小段，將根段裝入500 mL三角瓶中后倒入300 mL的1%次氯酸鈉溶液，封口后猛搖3 min，立即用蒸餾水沖洗數次，先后過200目和500目篩，用蒸餾水反復沖洗留在500目篩子上的卵，最后用無菌水沖洗收集于無菌的小燒杯中。將上述卵放于26℃無菌培養箱中孵化3 d，得到根結線蟲的2齡幼蟲[5]。

1.3 形態學鑒定

觀察頭部特征、口針特征等。測量20條線蟲體長、最大體寬、口針長和DEGO（背食道腺開口至口針基部球的距離）等形態指標。

雌成蟲會陰花紋的制作與觀察：參照王曦茁等[7]的方法，在體視顯微鏡下解剖根結線蟲的成熟雌蟲，將雌蟲移入硬塑料板上的一滴體積分數45%乳酸中，用解剖刀切取尾端（蟲體后部約1/4處），將尾端的體內組織去掉，切除尾端表皮多余的部分，僅留下會陰花紋部分。將會陰花紋轉移至一塊載玻片上的純甘油滴中，一個玻片上放10塊會陰花紋，以AFG液為浮載劑，用樹脂封片，制成永久玻片。在顯微鏡下觀察會陰花紋的形態特征并拍照。

1.4 同工酶鑒定

參照文獻[8-9]，通過垂直板聚丙烯凝膠電泳做酯酶分析。首先配制浸提液（20%蔗糖+2%TritonX-100）、1 mol/L Tris-HCl pH 8.9緩沖液、1 mol/L Tris-HCl pH 8.3緩沖液、1 mol/L Tris-HCl pH 6.8緩沖液、1%過硫酸銨溶液、0.2%溴酚藍。用移液器吸取5 μL浸提液至離心管中，將成熟雌蟲轉入管內，用研磨錐充分研磨，補加10 μL浸提液浸提酯酶同工酶。聚丙烯酰胺濃度分別為3%和7%。板大小為150 mm×120 mm，凝膠厚度1.5 mm，電極緩沖液為1 mol/L pH 8.3 Tris-HCl緩沖液。每孔加樣量為20 μL（含濃度為1 mg/mL溴酚藍溶液），電泳前30 min電壓設為80 V，之后在190 V下電泳2 h，直到溴酚藍指示條帶遷移距離達到10 cm。電泳結束后進行染色，顯色完全后用蒸餾水漂洗3次，之后在固定液（10%醋酸+10%甘油）中固定3 h以上，酯酶表型的命名參照文獻[9]，以室內培育已鑒定的南方根結線蟲Meloidogyne incognita樣本作為參照系判讀酯酶譜型，初步確定根結線蟲的種類。

1.5 分子生物學鑒定

1.5.1 DNA提取

根結線蟲的DNA提取方法參照磁珠法基因組提取試劑盒（天根）說明書并稍作優化。對花椒病根進行解剖，挑取根結線蟲成熟雌蟲，將根結線蟲雌蟲置于離心管并與研磨錐一同放入液氮中預冷后，用研磨錐研磨樣品，加入20 μL蛋白酶K，經水浴裂解30 min后，加入350 μL異丙醇，振蕩混勻后加入30 μL磁珠懸浮液，振蕩混勻后靜置3 min，反復3次;將離心管置于磁力架上，靜置。待磁珠完全吸附后，吸棄液體;加入700 μL緩沖液，振蕩混勻，吸棄液體;加入700 μL漂洗液，振蕩混勻后置于磁力架上靜置，吸棄液體后，將離心管置于室溫晾干;將離心管取下并加入200 μL洗脫緩沖液并振蕩混勻，56℃水浴10 min。之后將離心管置于磁力架上靜置2 min，待磁珠完全吸附后，吸取DNA溶液并置于新離心管內，之后將DNA產物保存至-20℃備用。

1.5.2 PCR擴增

采用根結線蟲ITS擴增通用引物[10]以及南方根結線蟲特異性引物[11]進行PCR擴增。ITS片段擴增引物名稱分別為F195：5′-TCC TCC GCT AAA TGA TAT G-3′和V5367：5′-TTG ATT ACG TCC CTG CCC TTT-3′，特異性擴增引物名稱分別為：MiSF：5′-GGG CAA GTA AGG ATG CTC TG-3′和MiSD：5′-GCA CCT CTT TCA TAG CCA CG-3′。PCR擴增采用25 μL反應體系：12.5 μL 2×FastLong Taq PCR MsaterMix， 1 μL上游引物（10 μmol/L），1 μL下游引物 （10 μmol/L），1 μL DNA，9.5 μL ddH2O。PCR反應條件為：95℃預變性3 min;94℃變性15 s，60℃退火15 s，72℃延伸20 s，反應共35個循環;最后72℃延伸10 min。4℃保存備用。PCR產物采用1.5%的瓊脂糖凝膠110 V電泳30 min進行檢測，用1×TAE作為電泳緩沖液，并在紫外燈下觀測照相。

1.5.3 產物克隆與測序

將純化后的ITS-PCR產物克隆至質粒載體pMD18-T（TaKaRa）上，選取每種群各5個陽性克隆由擎科公司測序。利用NCBI中的BLAST工具和DNAMAN 9.0軟件，將獲得的rDNA-ITS區序列與GenBank已登錄的根結線蟲序列進行比對分析。利用MEGA 6.0軟件通過鄰接法（neighbor-joining）構建系統發育樹，采用Maximum Composite Likelihood模型。同時對構建的系統樹作自展檢驗（bootstrap test）以獲得分支的支持率，自展檢驗中重復抽樣次數為1 000次，以秀麗隱桿線蟲Caenorhabditis elegans （X03680）的ITS序列作為外群。

2 結果與分析

2.1 九葉青花椒根結線蟲病癥狀

九葉青花椒感染根結線蟲后，植株矮小，葉片發黃、失綠，生長緩慢，感病嚴重的地塊，20%～30%的九葉青花椒樹死亡。九葉青花椒感病后其主根及根尖處開始膨大，并慢慢形成白色米粒狀根結，隨后側根根部也出現膨大現象，并形成不規則白色米粒狀根結，隨著病情加重，根結逐漸膨大，顏色由白色變為黃色，當根部腐爛壞死時根結變成黑色，其根結主要分布在10～30 cm土層。剖開米粒狀根結可見白色梨形雌蟲，說明九葉青花椒樹已感染根結線蟲。

2.2 根結線蟲形態學鑒定結果

雌蟲：體白色，梨形，頸短，頭區有不完整的環紋，口針纖細，口針基球呈扁圓形，同桿部的界線明顯;口針錐部向背部明顯彎曲，桿部末端較寬。

2齡幼蟲：蟲體呈線形，蠕蟲狀;頭冠前端平寬，頭部無突出與縊縮，有不完整環紋;口針纖細，錐部與桿部中等寬，基部縊縮且向后傾斜;尾有透明區。

會陰花紋：背弓高，呈方形，由平滑到波浪形的線紋組成。線紋在側面分叉，側線不明顯，線紋彎向陰門，尾端區無刻點（圖1）。

雌蟲與2齡幼蟲部分體長測量值如表1，參考文獻[12-14]，初步確定九葉青花椒根結線蟲為南方根結線蟲M.incognita。

2.3 酯酶同工酶酶譜

將分離純化的根結線蟲種群進行同工酶分析，電泳結果如圖2，該種群根結線蟲雌成蟲的酯酶同工酶譜均出現一條酯酶帶，酯酶譜帶類型為I1，相對遷移率為0.47，與南方根結線蟲相同，因此確定該根結線蟲為南方根結線蟲。

2.4 分子生物學特征

根據瓊脂糖凝膠電泳檢測ITS-PCR產物與特異性引物擴增產物的結果，表明九葉青花椒根結線蟲樣本的rDNA-ITS片段大小為700 bp左右（圖3），特異性擴增產物大小為500 bp左右（圖4），其ITS片段以及特異性擴增片段同南方根結線蟲的產物片段長度基本一致。將ITS-PCR產物所挑取的陽性克隆送至公司測序，通過DNAMAN 9.0拼接得到695 bp的ITS序列。將該序列上傳至GenBank上進行BLAST，結果表明，獲得的擴增產物ITS區域序列與已知南方根結線蟲ITS區域序列的相似性達到99%。用MEGA 6.0軟件構建系統發育樹（圖5）。從系統發育樹來看，5個九葉青花椒根結線蟲的ITS序列與南方根結線蟲的遺傳距離最近，支持率為97%，而與其他根結線蟲的遺傳距離相對較遠。結合其ITS系統發育樹以及特異性擴增產物，參照文獻[10-11]并進行條帶比較，說明在四川省發生的九葉青花椒根結線蟲病的病原為南方根結線蟲。

3 結論與討論

磁珠法提取DNA適用于微量材料DNA提取，提取的DNA純度高，濃度高，不含抑制劑，提取過程中無需過柱與離心，可有效避免提取微量材料的DNA時出現DNA損失，目前主要用于植物與動物DNA提取，廣泛應用于法醫學、分子生物學等領域[15-16]。目前國內尚未報道磁珠法用于提取線蟲DNA，常規根結線蟲的DNA提取方法主要通過裂解凍融法[17]，本文首次利用磁珠法成功提取根結線蟲DNA。通過對根結線蟲rDNA-ITS區域序列進行PCR擴增、克隆測序與比對，可有效鑒定根結線蟲種類[18-20]。從九葉青花椒根部分離的線蟲經rDNA-ITS片段比對以及特異性條帶擴增鑒定為南方根結線蟲M.incognita。本研究通過對九葉青花椒根結線蟲進行雌蟲和2齡幼蟲的形態學鑒定和成熟雌蟲的會陰花紋鑒定，以及雌蟲酯酶同工酶分析和rDNA-ITS序列系統發育樹的構建，結合特異性擴增條帶，結果表明侵染九葉青花椒的根結線蟲為南方根結線蟲M.incognita。本試驗在鑒定病原過程中，通過綜合形態學、分子生物學、生物化學等鑒定方法，有效避免因鑒定方法單一而產生誤差，做到準確、有效的分類[21]。這是我國首次報道由南方根結線蟲M.incognita引起九葉青花椒根結線蟲病害。

九葉青花椒屬于多年生樹種，3～4年進入盛產期，掛果期可延續至15年以上，生長壽命長達20～30年，故與常規農作物的根結線蟲病害防治工作相比，根結線蟲病害的防治工作具有長期性與持續性的特點，因此需結合不同地理條件與九葉青花椒生長期采取相應措施。

在進行育苗工作時，最好在無病區育苗，如若在發病區，可在育苗時進行育苗土預處理，可用石灰粉與表層土、腐熟有機肥進行攪拌混均，通過曝曬減少初侵染源。移栽幼苗時，注意檢查根部有無根結，選擇無病苗造林，同時在選擇造林地時最好不要選擇有根結線蟲的地塊。一旦發現病株，立刻就地銷毀，防止病情擴散。如若有根結線蟲，可對種植穴施用噻唑膦等殺線蟲劑進行土壤消毒。對已感染根結線蟲病的九葉青花椒林地，可通過使用生防真菌與生防細菌進行生物防治，減少土壤中根結線蟲數量[22-24]，并施用土壤修復劑，如碳酸氧氨與生石灰等堿性肥料，改善土壤條件，增加根際土壤有益微生物的數量以及植物根系的活力，從而達到有效防治根結線蟲病的目的。

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（責任編輯： 楊明麗）