黑龍江省大豆田反枝莧對氟磺胺草醚的抗藥性機制研究

滕春紅 王星茗 崔書芳

摘要 為明確反枝莧抗性種群對氟磺胺草醚的抗性機制，分別測定了氟磺胺草醚對反枝莧抗性和敏感種群體內原卟啉原氧化酶（PPO）、谷胱甘肽S-轉移酶（GSTs）、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）和過氧化氫酶（CAT）活性的影響。結果表明：氟磺胺草醚處理后，抗性和敏感反枝莧種群PPO活性均受到一定程度的抑制，但抗性種群活性受到抑制后能逐漸恢復，而敏感種群則不能恢復;施用氟磺胺草醚后，抗性和敏感反枝莧種群GSTs和SOD活性變化無明顯差異，抗性和敏感反枝莧種群POD和CAT活性均受到一定程度的抑制，但抗性種群活性受到抑制后能逐漸恢復，而敏感種群則不能恢復。研究表明，反枝莧抗性種群體內PPO對氟磺胺草醚敏感性降低是其產生抗藥性的原因之一，反枝莧POD和CAT對活性氧的抵御能力差異也可能與反枝莧對氟磺胺草醚的抗性有關。

關鍵詞 反枝莧; 氟磺胺草醚; 抗藥性機制

中圖分類號： S 481.4 ?文獻標識碼： A ?DOI： 10.16688/j.zwbh.2018406

Abstract To reveal the resistance mechanism of Amaranthus retroflexus L. to fomesafen， the enzyme assays of PPO， GSTs， POD， SOD， and CAT in both resistant （R） and susceptible （S） populations of A. retroflexus were performed. The results showed that the treatment of fomesafen inhibited the PPO activity in both R and S populations， and the PPO activity of R population could recover while that of the S population could not. After treatment with fomesafen， the activity changes of GSTs and SOD in both the R and S populations showed no obvious difference， while the POD and CAT activity was inhibited in both the R and S populations， and the POD and CAT activity in the R population could recover， while that of the S population could not. The results suggested that reduced sensitivity to PPO was one of the resistance mechanisms of A. retroflexus to fomesafen and the differences in the POD and CAT resistance to reactive oxygen species might also be related to the resistance of A. retroflexus to fomesafen.

Key words Amaranthus retroflexus; fomesafen; mechanism of resistance

根據國際抗除草劑雜草調查數據統計，截至2018年9月13日，全球已有255種（148種雙子葉，107種單子葉）雜草的495個生物型，對70個國家的92種作物田的26種已知作用機制中的23種，共計163種除草劑產生了抗藥性，幾乎涵蓋各類重要的除草劑[1-2]。抗性雜草已成為雜草治理和農業生產的嚴重威脅，由其引發的嚴重經濟和安全問題備受全球關注。

反枝莧Amaranthus retroflexus L.，別名西風谷、野米谷等，是我國農田、果園常見的一年生闊葉雜草[3-4]。目前防治該類雜草的主要藥劑是二苯醚類（diphenyl ether）除草劑，該類除草劑屬于原卟啉原氧化酶（PPO）抑制劑，具有除草效果好，殺草譜廣，選擇性強等特點。然而，由于其連年大量使用，已導致多種雜草對其產生了抗性。截至2018年9月13日，在7個國家已有13種雜草對PPO抑制劑產生了抗性[1]。

氟磺胺草醚（fomesafen）是二苯醚類除草劑的主要品種之一，在我國大豆田應用十分廣泛 [5-6]。但近年來，由于氟磺胺草醚的連年過量使用，防除反枝莧的效果開始下降，有些地區用藥3次也難以達到理想的防除效果。目前，有關雜草對除草劑抗性機制的研究主要集中在以下2個方面：1）雜草對除草劑靶標位點的敏感性發生改變;2）雜草代謝解毒能力增強。滕春紅等研究發現，黑龍江省黑河市嫩江縣采集點的反枝莧對氟磺胺草醚產生了高水平抗性，溫室盆栽法測得其抗性倍數為101.74[7]。Wuerffel等采用等位基因特異性PCR擴增了94個糙果莧A.tuberculatus種群的PPO基因，發現抗乳氟禾草靈生物型的PPX2L基因的第210位甘氨酸缺失，表明該位點缺失與糙果莧抗性生物體內PPO敏感性降低相關[8]。

為了進一步闡明反枝莧對氟磺胺草醚產生抗性的機制，為抗性雜草研究和治理提供理論依據，測定了氟磺胺草醚對抗性和敏感種群反枝莧體內原卟啉原氧化酶（PPO）活性、谷胱甘肽S-轉移酶（GSTs）活性、超氧化物歧化酶（SOD）活性、過氧化物酶（POD）活性和過氧化氫酶（CAT）活性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試植物

反枝莧抗性種群（R）于2014年9-10月采自黑龍江省嫩江縣前進鎮東升村大豆田，溫室盆栽法測得抗性生物型對氟磺胺草醚的抗藥性倍數為101.74[7];反枝莧敏感種群（S）于2014年9-10月采自黑龍江省牡丹江市東寧縣大肚川鎮非耕地，從未施用過除草劑。反枝莧經鑒定后晾干，裝入牛皮紙袋，保存在4℃冰箱待用。

1.1.2 供試除草劑

250 g/L氟磺胺草醚水劑，大連松遼化工有限公司生產。

1.1.3 供試試劑

甲硫氨酸 （Met）、四氮唑藍（NBT）、乙二胺四乙酸鈉（EDTA-Na2）、核黃素 （FD）、磷酸緩沖液、1%愈創木酚、30%H2O2溶液、硫代巴比妥酸（TBA）、三氯乙酸（TCA）、磷酸、無水乙醇、Tris-HCl緩沖液、黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD）、NaOH、KNO3、還原型谷胱甘肽、1-氯-2，4-二硝基苯（CDNB）。

原卟啉原氧化酶（PPO）ELISA酶聯免疫分析檢測試劑盒（江蘇酶免實業有限公司）。

1.1.4 供試儀器設備

雙光束紫外可見分光光度計（TU-1901）、酶標儀（352型）高速冷凍離心機ST 16R、離心管、移液槍、石英比色皿、研缽。

1.2 方法

采用盆栽法。在每個營養缽中均勻播種20粒反枝莧種子，上面蓋2 cm細土并鎮壓。出苗后間苗，每盆保留10株。3～5葉期進行莖葉處理，250 g/L氟磺胺草醚水劑的有效用藥量為150 g/hm2。試驗采用隨機區組設計，每處理4次重復，設置清水作為對照，試驗重復2次。分別于施藥前、施藥后1、3、5、7和14 d剪取不同種群反枝莧葉片，稱重后作為試驗樣品。樣品于-20℃保存，冰浴磨樣，分別測定PPO活性、GSTs活性、SOD、POD及CAT活性。

1.2.1 PPO活性的測定

PPO活性測定按照酶活性檢測試劑盒（江蘇酶免實業有限公司）步驟進行，利用酶標儀檢測。

1.2.2 谷胱甘肽S-轉移酶（GSTs）活性的測定

參照Pamela等、陶波等[9-10]的方法并改進，取0.2 g反枝莧葉片制成待測酶液。取0.5 mL 3.0 mol/L谷胱甘肽溶液，加入2.3 mL 0.1 mol/L pH=6.5的磷酸緩沖液，加入50 μL上述待測酶液，最后加入20 mmoL/L的CDNB 0.15 mL，并設蒸餾水對照調零。在340 nm波長處檢測其吸光值在2 min內的變化，并記錄OD值。以1 mg/L蛋白10 min催化反應，吸光值變化0.001為一個酶活性單位（1U），以1 mg/L可溶性蛋白的含量表示為GSTs酶活性。

1.2.3 SOD、POD和CAT活性測定

分別取0.2 g反枝莧葉片制成待測酶液。參照并改進Giannoplitis等[11]的方法測定SOD活性，在560 nm波長下測定各管的吸光度，以抑制氮藍四唑（NBT）光化還原50%為一個酶活性單位（U）表示酶活力;參照并改進郝再彬等[12]的方法測定POD活性，在470 nm波長下比色，每隔1 min記錄一次，記錄3 min內的變化值，以吸光度變化0.01為一個酶活性單位（U）表示酶活力;參照并改進劉亞光等[13]的方法測定CAT活性，在240 nm下比色，每隔1 min記數一次，共讀數3次，以每分鐘吸光度的變化值表示酶活力的大小。

1.2.4 數據處理

數據采用DPS 7.05軟件進行統計分析。用Excel 2010做折線圖，以標準差定義誤差線。

2 結果與分析

2.1 氟磺胺草醚對不同反枝莧種群PPO活性的影響

氟磺胺草醚對不同反枝莧種群PPO活性的影響如圖1所示。施藥前R種群的PPO活性是S種群的1.42倍。施用氟磺胺草醚后，R種群和S種群的PPO活性均隨著處理時間的增加呈先降低后升高再降低的趨勢，R種群在處理3 d到14 d一直高于或接近對照水平，S種群的PPO活性一直低于對照水平。施藥后14 d，R種群和S種群的PPO活性分別比對照組降低了6.41%和47.44%。

2.2 氟磺胺草醚對不同反枝莧種群GSTs活力的影響

氟磺胺草醚對不同反枝莧種群GSTs活性的影響如圖2所示。施藥前R種群的GSTs活性是S種群的1.92倍。施用氟磺胺草醚后，R種群和S種群GSTs活性隨著施藥天數的增加呈先降低后升高再降低的趨勢。施藥后14 d，R種群和S種群GSTs活性分別比對照組降低了9.51%和11.54%。

2.3 氟磺胺草醚對不同反枝莧種群SOD活性的影響

氟磺胺草醚對不同反枝莧種群SOD活性的影響如圖3所示。施藥前R種群SOD活性是S種群的1.45倍。施用氟磺胺草醚后，R種群和S種群SOD活性隨著施藥天數的增加呈先降低后升高再降低的趨勢。R種群和S種群均可以恢復到接近對照水平。施藥后14 d，R種群和S種群SOD活性分別比對照組降低了2.13%和3.94%。

2.4 氟磺胺草醚對不同反枝莧種群POD活性的影響

氟磺胺草醚對不同反枝莧種群POD活性的影響如圖4所示。施藥前R種群的POD活性是S種群的1.55倍。施用氟磺胺草醚后，R種群和S種群的POD活性均隨著施藥天數的增加呈先降低后升高再降低的趨勢。施藥后14 d，R種群的POD活性比對照組增加了8.02%，S種群的POD活性比對照組減少了14.63%。

上述結果表明，在受到氟磺胺草醚脅迫后，R種群POD活性能逐漸恢復并增強來防御活性氧對植物組織內細胞膜的傷害，而S種群則不能恢復。

2.5 氟磺胺草醚對不同反枝莧種群CAT活性的影響

氟磺胺草醚對不同反枝莧種群CAT活性的影響如圖5所示。施藥前R種群CAT活性是S種群的1.57倍。施用氟磺胺草醚后，R種群和S種群CAT活性隨著施藥天數的增加呈先降低后升高再降低的趨勢。施藥后14 d，R種群和S種群的CAT活性分別比對照組降低了3.21%和13.83%。

上述結果表明，在受到氟磺胺草醚脅迫后，R種群和S種群的CAT活性均受到抑制，R種群CAT活性能逐漸恢復來防御活性氧對植物組織內細胞膜的傷害，而S種群則不能恢復。

3 結論與討論

靶標酶活性、代謝酶GSTs活性以及保護酶（SOD、POD、CAT）活性是衡量除草劑對雜草脅迫情況的重要指標[14-15]。氟磺胺草醚屬于二苯醚類除草劑，該類除草劑的作用靶標是原卟啉原氧化酶（PPO），此類除草劑主要通過抑制葉綠素生物合成途徑中合成四吡咯所必需的原卟啉原氧化酶來防治雜草[16]。氟磺胺草醚處理后，抗性和敏感反枝莧種群PPO活性均受到一定程度的抑制，但抗性種群活性受到抑制后能逐漸恢復，而敏感種群則不能恢復。說明氟磺胺草醚對反枝莧抗性種群PPO活性的抑制作用不明顯，而對敏感種群PPO活性的抑制作用較大。

GSTs在雜草對除草劑的抗藥性中起著非常重要的作用[17]。王笑等認為GSTs的類型和活性的大小可作為植物抗除草劑能力的一個重要指標[18-20]。氟磺胺草醚脅迫后，R種群和S種群GSTs活性均受到抑制，然后通過逐漸提高活性來減少這種抑制作用，但不能恢復到對照水平。R、S種群GSTs活性變化趨勢基本一致，不存在明顯差異。說明反枝莧體內GSTs對進入到葉片組織中的氟磺胺草醚有一定的代謝能力，從而部分地減弱氟磺胺草醚對反枝莧組織的傷害。

植物體內存在著許多種抗氧化酶，SOD、POD及CAT在清除植物體內活性氧對植物細胞質膜以及細胞膜等膜系統的傷害方面起著重要作用[21]。許多研究表明，在抗性雜草種群中代謝解毒酶SOD、POD及CAT活性增強[13，22-23]。氟磺胺草醚脅迫后，R、S種群的SOD活性均受到抑制，而后SOD活性逐漸恢復來防御活性氧對植物組織內細胞膜的傷害，抗性和敏感反枝莧種群SOD活性變化無明顯差異，R、S種群的POD和CAT活性均受到一定程度的抑制，但抗性種群活性受到抑制后能逐漸恢復，而敏感種群則不能恢復。這與劉亞光等研究稗草種群對莠去津、乙草胺和硝磺草酮的抗性機理及馬紅等研究野黍對煙嘧磺隆的抗性機理的結果相似[13，23]。

細胞色素酶系在除草劑的選擇性和雜草抗藥性方面也發揮著重要的作用[8]，而抗氟磺胺草醚反枝莧生物型體內P450 酶系活性的變化規律還有待于進一步研究。反枝莧對氟磺胺草醚抗性的分子機制也有待進一步研究。

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（責任編輯： 田 喆）