防治紅棗黑斑病的殺菌劑篩選和復配研究

劉礎榮 董玥 呂青陽

摘要 采用菌絲生長速率法和孢子萌發抑制法，測定了14種殺菌劑單劑及基于單劑篩選結果的二元復配劑對紅棗黑斑病菌Alternaria tenuissima菌絲生長和孢子萌發的抑制作用，以此評價防治紅棗黑斑病的殺菌劑和復配藥劑的效果。結果表明，咯菌腈和嘧菌環胺對靶標病菌菌絲生長的抑制效果最佳，其EC50分別為0.091 3和0.099 8 μg/mL;吡唑醚菌酯和啶酰菌胺對病菌孢子萌發抑制效果最佳，其EC50分別為0.015 3和0.293 4 μg/mL。吡唑醚菌酯與戊唑醇按照8∶2和3∶7（w/w）的比例進行復配，對病菌菌絲生長的抑制表現出相加作用，其SR值分別為1.124 5和0.916 9;兩者以5∶5和3∶7（w/w）的比例進行復配，對孢子萌發的抑制表現出相加作用，其SR值分別為1.164 6和0.901 0。吡唑醚菌酯、啶酰菌胺、咯菌腈、嘧菌環胺和異菌脲等對病菌菌絲生長和孢子萌發均有抑制效果;吡唑醚菌酯與戊唑醇3∶7（w/w）復配對病菌菌絲生長及孢子萌發的抑制效果均表現出相加作用。上述結果為紅棗黑斑病防治藥劑的開發和后續田間應用提供了理論支持。

關鍵詞 紅棗黑斑病; 鏈格孢菌; 毒力測定; 藥劑復配

中圖分類號： S 432.1 ?文獻標識碼： B ?DOI： 10.16688/j.zwbh.2018438

Abstract In order to evaluate the effect of fungicides for controlling black spot of jujube （Ziziphus jujuba）， 14 fungicides as well as their cocktail mixture were screened by measuring the mycelial growth and spore germination. The results indicated that mycelial growth of Alternaria tenuissima was strongly inhibited by fludioxonil and cyprodinil， with the EC50 values of 0.091 3 and 0.099 8 μg/mL， respectively. The spore germination was strongly inhibited by pyraclostrobin and boscalid， with the EC50 values of 0.015 3 and 0.293 4 μg/mL， respectively. The mixture of pyraclostrobin and tebuconazole had an additive effect on the inhibition of mycelial growth at the ratio of 8∶2 or 3∶7（w/w）， with the synergistic ration （SR） value of 1.124 5 and 0.916 9， respectively. The mixture of these two fungicides also had an additive effect on the inhibition of spore germination at the ratio of 5∶5 or 3∶7（w/w）， with the SR value of 1.164 6 and 0.901 0， respectively. In conclusion， pyraclostrobin， boscalid， fludioxonil， cyprodinil and iprodione showed inhibition effects on mycelial growth and spore germination. The mixture of pyraclostrobin and tebuconazole at the ration of 3∶7 had additive effect both on mycelial growth and spore germination， indicating that these fungicides and mixture supplied an alternative choice for jujube black spot disease control in field.

Key words jujube black spot; Alternaria sp.; toxicity test; fungicide mixture

棗樹 Ziziphus jujuba為鼠李科棗屬植物。紅棗是我國特有的優質水果。我國擁有全世界98%的紅棗種質資源，并為世界貢獻了99%的紅棗產量[1-2]。近年來，新疆已經成為我國最重要的優質商品紅棗生產基地，在喀什、阿克蘇及和田形成了三大紅棗主產區。據2016年國家統計局數據[3]，新疆紅棗年產量326.42萬t，居全國第一。伴隨紅棗產業的快速發展，棗園病害發生嚴重，其中紅棗黑斑病自2009年在和田等地首次發現，2010年在阿克蘇地區大面積發生[4]，2013年南疆多個地區再次大面積發生，果實發病率高達20%～30%，嚴重危害紅棗產量和品質，造成巨大的經濟損失[5]。

引起新疆維吾爾自治區紅棗黑斑病的主要病原菌為細極鏈格孢Alternaria tenuissima[6]。該病原菌可引起多種植物病害，曾導致美國伊利諾伊州大豆發生猝倒病而減產15%[7];該菌在印度引起茄子葉斑和茄果腐爛病[8]，在伊朗引起草莓葉斑病[9]。在國內也有細極鏈格孢引起五味子黑斑病[10]和棗縮果病[11-12]的報道。該病原菌除引起病害還能夠產生交鏈格孢霉烯和鏈格孢酚等真菌毒素，嚴重威脅食品安全[13]。

目前，新疆地區主要通過施用化學藥劑防控紅棗黑斑病，但缺少針對紅棗黑斑病的高效藥劑[14]以及更加科學的施藥方案。因此，本文針對防治紅棗黑斑病的殺菌劑進行了單劑篩選和Wadley法復配研究，旨在為紅棗黑斑病防治藥劑的開發和田間應用提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試藥劑

供試的14種殺菌劑均由中國農業大學植物病理學系種子病理與殺菌劑藥理學研究室提供（表1）。

1.1.2 靶標病菌

引起紅棗黑斑病的細極鏈格孢A.tenuissima菌株由塔里木大學植物科學學院提供。

1.1.3 培養基

PDA培養基：馬鈴薯200 g，葡萄糖18 g，瓊脂粉14 g，去離子水1 L。

水瓊脂：瓊脂粉10 g，去離子水1 L。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株活化

將供試菌株接種在PDA平板上，28℃黑暗培養5 d后備用。

1.2.2 殺菌劑對A.tenuissima菌絲生長的影響

采用中華人民共和國農業行業標準 （NY/T1156.2-2006）中的平皿菌絲生長抑制法進行試驗[16]。供試殺菌劑均以二甲基亞砜為溶劑配制為1 000 μg/mL的母液，再依次稀釋為100、10、1、0.5、0.1、0.01和0.001 μg/mL 7個濃度，制成含藥PDA平板。以添加等體積的溶劑和蒸餾水作為溶劑和空白對照。用直徑5 mm的打孔器在靠近菌落邊緣的同一圓周上打取菌餅并接種到不同濃度的含藥PDA平板中央，每濃度3次重復。28℃黑暗培養5 d，采用十字交叉法測定菌落直徑，計算相對抑制率。

相對抑制率=（對照菌落直徑-處理菌落直徑）/對照菌落直徑×100%;

以設定濃度的對數為橫坐標（x），抑制率幾率值為縱坐標（y），求出各藥劑對供試病菌的毒力回歸曲線方程y=ax+b、決定系數R2以及有效抑制中濃度（EC50）。最后根據EC50，分析比較不同殺菌劑對供試病菌菌絲生長的影響。

1.2.3 殺菌劑對A.tenuissima孢子萌發的影響

將5 mm的A.tenuissima菌餅菌絲面朝下接種到PDA平板中央，28℃黑暗培養8 d，待菌絲鋪滿整個平板后加入10 mL無菌水洗脫孢子，用4層紗布過濾獲得孢子懸浮液。加入無菌水制備成濃度為1×106個/mL的分生孢子懸浮液[17]。吸取150 μL分生孢子懸浮液均勻涂布在含不同濃度藥劑的水瓊脂平板上，25℃黑暗培養6 h后鏡檢（放大倍數10×10），每濃度3次重復，每次重復調查100個分生孢子。孢子萌發的標準為芽管長超過孢子長度的一半[18]。計算殺菌劑對紅棗黑斑病菌分生孢子萌發的抑制率。

孢子萌發率=（萌發孢子數/孢子總數）×100%;

相對抑制率=（對照組孢子萌發率-處理組孢子萌發率）/對照組孢子萌發率×100%。

1.2.4 殺菌劑復配設計

根據供試殺菌劑單劑對菌絲生長和孢子萌發的EC50測定結果，最終選取吡唑醚菌酯和戊唑醇進行復配，評價藥劑混用后的聯合作用。將吡唑醚菌酯和戊唑醇按2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2等進行復配，測定復配劑對供試菌株菌絲生長和孢子萌發的EC50，同時按Wadley法計算增效系數（SR）。SR<0.5為拮抗作用，0.5≤SR≤1.5為相加作用，SR>1.5為增效作用[19]。

SR=EC50（理論）/EC50（實際）;

EC50（理論）=a+baEC（A）50+bEC（B）50。

a、b分別為相應單劑在復配劑中所占比例，A、B分別為吡唑醚菌酯和戊唑醇。

2 結果與分析

2.1 供試殺菌劑單劑對A.tenuissima菌絲生長的影響

藥劑對A.tenuissima菌絲生長的影響如表2所示。咯菌腈和嘧菌環胺對菌絲生長的抑制效果最佳，其EC50分別為0.091 3和0.099 8 μg/mL;其次為異菌脲、咪鮮胺、己唑醇、吡唑醚菌酯、咪鮮胺錳鹽、氟硅唑和苯醚甲環唑，其EC50范圍在0.268 8～0.515 6 μg/mL;丙環唑、啶酰菌胺、腐霉利、嘧菌酯和戊唑醇的EC50范圍在1.188 8～3.256 1 μg/mL。

2.2 供試殺菌劑單劑對A.tenuissima孢子萌發的影響 ?供試藥劑對A.tenuissima孢子萌發的影響如表3所示。其中，吡唑醚菌酯對孢子萌發的抑制效果最佳，EC50為0.015 3 μg/mL;其次為啶酰菌胺，EC50為0.293 4 μg/mL;嘧菌酯、異菌脲、咯菌腈和腐霉利的EC50范圍在1.692 4～4.016 4 μg/mL;嘧菌環胺的EC50為19.134 μg/mL。7種細胞膜甾醇合成抑制劑在供試濃度下對A.tenuissima孢子萌發均沒有抑制效果。

2.3 供試殺菌劑復配藥劑對A.tenuissima菌絲生長的影響 ?吡唑醚菌酯和戊唑醇的不同配比組合對A.tenuissima菌絲生長的影響如表4所示。除吡唑醚菌酯∶戊唑醇=5∶5（w/w，下同）表現出拮抗作用外，其余6種配比均表現出相加作用。其中吡唑醚菌酯∶戊唑醇=8∶2時增效最明顯，其SR值為1.124 5;其次為3∶7和2∶8的配比組合，其SR值分別為0.916 9和0.818 4;吡唑醚菌酯和戊唑醇的配比為6∶4、7∶3和4∶6時相加作用不顯著。

2.4 供試殺菌劑復配藥劑對A.tenuissima孢子萌發的影響 ?吡唑醚菌酯和戊唑醇的不同配比組合對A.tenuissima孢子萌發的影響如表5所示，其中吡唑醚菌酯：戊唑醇=5∶5時相加作用最為明顯（SR值=1.164 6），3∶7、2∶8、6∶4和4∶6 4個配比也表現為相加作用，其SR值分別為0.901 0、0.798 3、0.720 2和0.520 6，而8∶2和7∶3表現為拮抗作用。

3 結論與討論

本研究選用14種殺菌劑單劑對A.tenuissima進行了菌絲生長和孢子萌發抑制試驗，結果表明咯菌腈、嘧菌環胺、異菌脲、咪鮮胺、己唑醇、吡唑醚菌酯、咪鮮胺錳鹽、氟硅唑和苯醚甲環唑等9種藥劑對A.tenuissima菌絲生長有抑制活性;吡唑醚菌酯和啶酰菌胺對病原菌孢子萌發有抑制效果;以三唑類為代表的麥角甾醇生物抑制劑對病原菌孢子萌發均沒有明顯的抑制效果，這與麥角甾醇生物合成抑制劑的作用機理相關，有研究認為麥角甾醇生物抑制劑對菌絲生長有顯著影響，但不影響孢子萌發[20]。這與本研究結果一致。

吡唑醚菌酯的作用機理是阻止呼吸作用復合物Ⅲ中細胞色素b和c1之間的電子傳遞，使線粒體無法為細胞提供能量而導致其死亡，達到殺死病原菌的目的。吡唑醚菌酯能抑制病原菌菌絲生長也能抑制孢子萌發，具有治療、保護、鏟除、強內吸性及耐雨水沖刷等特性[21-22]，已被用于許多真菌病害的防治，且在大豆[23]、玉米[24]及棉花[25]等作物上的保健、增產和促生作用被不斷證明;戊唑醇是1986年德國拜耳公司開發的一種高效、廣譜、低毒的三唑類殺菌劑，其作用機理是抑制真菌細胞壁中麥角甾醇中間體的氧化脫甲基反應從而抑制病原菌生長[26]，具有保護、治療、鏟除及持效期長等特性。

吡唑醚菌酯和戊唑醇均為高效、廣譜、低毒的殺菌劑，且作用類型不同。本文選擇這兩種藥劑進行復配，研究其單劑和復配劑對病原菌菌絲生長和孢子萌發的影響，采用Wadley法計算復配藥劑的增效系數，最終獲得了對A.tenuissima菌絲生長和孢子萌發抑制均表現出相加作用最優復配組合。

紅棗黑斑病是近年來流行在新疆紅棗產區的主要病害之一，對紅棗的生產和品質造成了嚴重的影響，多種殺菌劑交替使用或運用復配藥劑可以緩解由于長期施用單一殺菌劑產生的抗藥性問題，延長殺菌劑的使用壽命。另一方面，戊唑醇的價格遠低于吡唑醚菌酯，二者復配還能降低田間用藥成本。本研究為紅棗黑斑病的科學用藥提供了理論支持。但在自然條件下，由于氣候、施藥時期和方式、藥劑與病原菌的接觸程度等因素，室內毒力測定試驗的結果往往與田間試驗獲得的結果有一定偏差。因此，本研究篩選出的單劑和混劑配比還需田間試驗進一步驗證。

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（責任編輯： 楊明麗）