精準醫學背景下關于臨床PCR擴增實驗室存在的不足及反思

朱一帆 時超杰 李莎莎 何敖林

[摘要] 近年來精準醫學的應用不斷擴大，促進了PCR實驗室的蓬勃發展，同時PCR實驗室的檢測準確度也影響著精準醫療的臨床效果。PCR技術要求相對較高，稍有污染或操作不慎就容易造成結果偏差，所以檢查實驗室的疏漏和改進完善尤為重要。

[關鍵詞] 精準醫學;PCR實驗室;檢測準確度

[中圖分類號] R19 [文獻標識碼] A [文章編號] 1672-5654（2019）09（b）-0023-03

近年來隨著基因組測序技術的不斷進步以及大數據科學的快速發展，精準醫學—一種新型醫學概念與醫療模式受到越來越多人的廣泛關注。精準醫療是指利用患者的基因組信息，再與蛋白質組學等相關內環境信息相結合，最后制定出針對患者的一套包括精確診斷、用藥及預后判斷的治療方案，可以實現治療效益最大化和醫療資源配置最優化[1]?；驒z測是精準醫療中最基礎的一環，數據的背后都離不開PCR實驗室的支持，因此PCR實驗室出具的檢測結果的準確性就顯得尤為重要?，F在PCR技術已經在傳染病、腫瘤靶向、生殖遺傳等領域被廣泛應用，但因為該技術對待測核酸進行了多次、大量的擴增，所以即使極微量的污染也容易導致結果出現假陽性;其次PCR技術要求相對較高，實驗過程繁復，中間環節如果出現遺漏疏忽，就有可能導致結果假陰性。為避免結果假陰性、假陽性以及出現誤差，需要實驗室人員及時發現實驗室存在的不足并加以改正，這樣才能為臨床的進一步治療提供最精準的數據。

1 ?該院臨床PCR擴增實驗室介紹

1.1 ?PCR實驗室的基本概況

基于昆山地區腫瘤發生率逐年增高的現狀，該PCR擴增實驗室計劃引進部分高端分子診斷項目，在此基礎上開展藥物基因組學檢測、腫瘤分子靶向檢測、生殖及遺傳相關疾病的檢測，以提高醫院的分子診斷水平。該PCR實驗室為昆山市第一人民醫院臨床實驗研究中心下設的專業分子檢測實驗室，按照《醫療機構臨床基因擴增檢驗實驗室管理辦法》建立，并通過江蘇省臨床檢驗中心認證，從事臨床標本的基因擴增檢測及相關實驗工作。該PCR實驗室主要通過實時熒光PCR技術檢測基因位點做出臨床診斷，由試劑貯存準備區、標本制備區、擴增區和產物檢測區4個區組成，配備有副主任檢驗師1名，主管檢驗師1名，初級檢驗師2名。

1.2 ?現開展的臨床項目簡介

該PCR實驗室現已開展及計劃開展基因檢測項目共7項，包括EGFR基因突變檢測、MTHFR基因突變檢測、ALDH2基因突變檢測、CYP2C9基因突變檢測、VKORC1基因突變檢測、CYP2C19基因突變檢測、藥物性耳聾基因突變檢測，主要為針對抗凝藥物、腫瘤藥物、葉酸、氨基糖苷類抗生素等藥物的臨床基因檢測。目的在于檢測藥物對不同基因型人群是否有效、指導最適劑量、檢驗藥物療效、提示不良反應。

2 ?PCR實驗室現存在的不足

2.1 ?PCR實驗過程中易發生污染

產生污染主要有以下4個原因：①是PCR擴增產物的污染。這也是最常見的污染原因。PCR產物經反復多次的擴增，其復制量遠遠超過PCR的檢測極限，所以即使是極微量的污染也足以造成實驗結果假陽性。②試劑的污染。在試劑的配制過程中，接觸了污染的容器、移液器、槍頭、溶液等物導致試劑被污染。③待測樣品被污染。放置樣品的容器被污染或由于容器密封不嚴導致樣品與外界接觸被污染;其次在核酸提取過程中使用了被污染的移液器或槍頭導致樣品被污染;另外，某些樣品中含有病毒，若彌散到空氣中則有可能形成交叉污染。④氣溶膠污染。若氣溶膠中包含病毒等污染物擴散至空氣中極有可能造成PCR產物污染。氣溶膠是由空氣與液體表面摩擦而產生的，開蓋、晃動反應管及污染加樣器的反復吸樣都可形成氣溶膠從而導致交叉污染。據計算一個氣溶膠顆?？珊?8 000拷貝，因此，應尤其重視由氣溶膠導致污染的問題[2]。PCR實驗室只要出現了污染，之前的結果報告就變為無效而且也無法進行其他的實驗操作。必須找出并徹底清除污染源，才能得到準確有效的實驗結果。

2.2 ?實驗室的質量控制存在缺陷

實驗室的質量控制分為：室內質量控制和室間質量控制。室內質量控制是指實驗室人員通過一定的方法和步驟，連續評價實驗室工作的可靠程度，旨在監測和控制實驗室常規工作的精密度，提高實驗室常規工作中批內、批間樣本檢驗的一致性，以確定測定結果是否可靠及可否發出報告的一項工作[3]。室間質量控制是指客觀比較實驗室的測定結果與靶值的差異，由外部機構采取一定的方法，連續、客觀地評價實驗室的結果，發現誤差并校正結果，使各實驗室之間的結果具有可比性[4-5]。該實驗室存在以下幾個缺點：①使用的質控品因為存放時間長久，存在使用時間超過保質期的問題，并且質控品來源單一導致不能及時發現質控品的質量問題;②質量控制的方法在SOP文件中表述不明確;③出現失控后反思問題分析原因不夠全面、深入，多為混勻不充分、移液器存在誤差、孵育時間不夠等粗略的理由;④質控周期太長，如果實驗過程中存在疏漏，不能及時發現并改正。

2.3 ?規范管理不到位

為了提高實驗室的檢測質量，避免實驗室污染以及確保實驗室的生物安全，規范有效的管理是實現這一切的根本措施。但有時會出現管理不到位甚至是疏忽的地方，比如隨意出入實驗室，甚至逆行;沒有按照規范穿戴口罩、鞋套;試驗期間緩沖間兩側門同時打開;實驗完畢后忘記開紫外燈消毒等。這些不規范的行為為實驗室的安全和污染埋下了隱患，從而影響檢驗結果的準確性。因此，有效的管理和實驗室操作規程的規范執行尤為重要。

3 ?改進方法

3.1 ?防治污染的措施

3.1.1 ?實驗室清潔 ?①每個實驗區都應配備專用的消毒試劑、工具。②如有樣本或者試劑外濺的情況，應立即先用 10%次氯酸鈉擦拭，再用清水擦洗，作好記錄。③實驗結束后用10%次氯酸鈉對有可能被污染的區域如桌面、生物安全柜等進行消毒，并用移動消毒車對這些區域消毒（30 min）。④每日結束工作后用10%次氯酸鈉擦拭移液器。⑤在實驗結束離開實驗室前，開啟室內紫外燈定對實驗室進行紫外照射消毒（60 min）。⑥工作服需要每周交于洗衣房清洗消毒，而且不可將不同區的工作服于同一天清洗。

3.1.2 規范操作 ?①在操作中佩戴手套避免接觸到與試管內面，使用帶濾芯的吸頭、離心管。②取樣，加標本、反應液之前應先高速離心將管蓋上液體沉于管底，以避免開蓋時液體飛濺和產生氣溶膠污染環境[6]。③若發生液體飛濺，首先隔離相關未被污染的物品，其次用吸水紙將液體吸干，再用2 000 mg/L的次氯酸鈉消毒液覆蓋30 min，75%乙醇擦拭2遍，最后用紫外燈消毒39 min[7]。

3.1.3 廢棄物的處理 ?①剩余血液的處理：由實驗室工作人員在每工作日下午16：00交科洗滌人員連同盛血用的試管一起置黃色垃圾袋中送醫療器具處理公司處理，并記錄。②一次性塑料吸管、移液器吸頭的處理：實驗過程中使用后的一次性塑料吸管、移液器吸頭放入含10%次氯酸鈉的廢物缸中，每天工作結束后，置黃色垃圾袋中交科洗滌人員送醫療器具處理公司處理，并記錄。③廢棄的擴增產物的處理：置于一次性塑料袋中，再放至黃色垃圾袋中，交專門人員處理，并記錄。④使用過的一次性口罩、手套、帽子等，放置于黃色垃圾袋中，交科洗滌人員送醫療器具處理公司，并記錄。

3.2 ?提高PCR實驗室的質量控制水平

PCR實驗室的質量控制應注意以下幾點：①選擇質控品時應考慮其濃度、基質、穩定性等特性，表達陰性質控品可作定量試驗，表達弱陽性和陰性質控品可作定性試驗。②擴大質控品的來源，選擇不同廠家的同一種質控品分別做質控試驗，對比結果。③為更好地監測每一個孔的擴增有效性，建議對質控品每次擴增的位置進行順延，順延規則應在SOP文件中表述清楚。④出現失控后反思問題不能流于表面，應該多從以下幾個方面考慮：核酸的提取過程中是否存在誤差、擴增時各個反應孔之間的溫度升降是否一致、探針的純度、標記效率是否符合標準、實驗人員的技術水平是否達標[8]。⑤縮短質控的試驗周期，以便及時發現問題并處理問題。

3.3 ?加強PCR實驗室的規范管理

①設備的管理：儀器設備的管理由實驗室負責人組織執行和監督管理。需定期作校準或檢定的儀器應有校準。PCR實驗室每個分區的儀器設備均為專用。實驗人員必須先熟悉掌握儀器的操作流程和相關性能才能使用該儀器，并經實驗室負責人考核認可后方可進行儀器操作。主要儀器使用后應做好使用記錄和日常維護，如高速冷凍離心機、基因擴增儀等。實驗室儀器應由專門人員管理維護，非本室人員在使用儀器時應有專人指導并作好記錄。

②人員的管理。實驗人員必須嚴格遵守實驗室的各項規章制度和操作流程。由實驗室負責人安排本實驗室人員的工作，如常規檢驗工作、設備維修管理、實驗室清潔消毒等。新安排人員須經基因擴增技術培訓并取得合格證后方可上崗。加強實驗人員“無基因、防污染”的概念及生物安全培訓。安裝門禁系統、氣鎖連動門等措施來加強管理。實驗人員進入實驗室路徑：公共清潔區—更衣區—緩沖間—污染實驗區。實驗室人員退出實驗室路徑：污染實驗區—緩沖間—更衣區—公共清潔區，不可逆行。

4 ?小結

精準醫學時代的來臨使得醫學實踐變得越來越個體化，它從每個人在基因、環境等方面的差異，為每位患者提供最適合的治療。在精準醫學不斷發展普及的大趨勢下，PCR的臨床應用也從最初的感染性疾病的檢測，到現在腫瘤的診斷與個體化治療、產前篩查及遺傳病診斷等。因此要獲得精準的數據就需要嚴格按照實驗室規范來進行工作，及時發現疏漏并改正，不斷反思改進，只有規范PCR的臨床應用，才能更好地為臨床一線服務。

[參考文獻]

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[3] ?李金明.實時熒光PCR技術[M].北京：人民軍醫出版社，2007：55-60.

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[6] ?郭利華.PCR實驗室的污染及控制措施[J].國際檢驗醫學雜志，2016，37（16）：2354-2355.

[7] ?Herero R，Castelsague X，Pawlta M，et al.Human papil- lomaviruses and oral caner：the international agencyfor research on cacer multcenter sdudy[J].J NATL Cancer Int，2003，95（1）：1772-1783.

[8] ?曾艷芬，陳發林.臨床基因擴增檢驗實驗室技術審核中存在的問題分析[J].國際檢驗醫學雜志，2014，35（19）：2711-2712.

（收稿日期：2019-06-19）