訶子對低密度脂蛋白所含蛋白apoB100氧化修飾抑制效果的研究

,4,4,*

(1.九江學院藥學與生命科學學院,江西九江 332000;2.江西中醫藥大學藥學系,江西南昌 330004;3.九江安德和生物科技有限公司,江西九江 332000;4.六盤水師范學院生物科學與技術學院,六盤水特色果樹資源研究與利用重點實驗室,貴州六盤水 553004)

訶子(TerminaliachebulaRetz,TCR)為使君子科欖仁樹屬植物訶子及其變種絨毛訶子的成熟干燥果實,具有降血糖、抗誘變、防治肝臟疾病、抗癌及抗氧化等多種功效[1],在藏藥中有“藥中之王”的美譽[2]。

低密度脂蛋白(low density lipoprotein,LDL)是平均直徑22 nm、密度1.019～1.063 g/mL左右的顆粒,由約80%脂類及單一蛋白apoB100(約占20%)組成[3-4]。LDL為人類血液循環中膽固醇的主要運輸載體,是膽固醇轉移和新陳代謝的關鍵物質[3]。LDL所含脂類及蛋白均容易被過渡金屬離子、自由基等物質所氧化[3,5]。LDL氧化是動脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)形成的關鍵因素[6],而AS是引起心血管疾病和腦梗塞的最主要原因[7]。在特定生理條件下,LDL所含的脂類及蛋白組分均易被氧化而導致其生化及熒光特性發生改變,可通過監測這些特性的變化反映被氧化修飾程度[5,8-9]。

熒光光譜具有高靈敏度、選擇性和多功能性等優勢,被廣泛運用于各種蛋白熒光特性的表征[8]。三維熒光掃描則可直觀顯示樣品在一定發射和激發波長范圍內的熒光變化情況,該變化可通過三維熒光等高線光譜圖顯示出來[8]。

LDL所含脂類氧化產生的醛類(如MDA)[10]會導致Lys上的游離氨基活性降低[8],在340 nm處測定OD值的變化可反映Lys游離氨基活性衰減程度[5]。除了脂類易發生氧化以外,LDL所含蛋白apoB100也容易發生氧化反應,導致其熒光發生相應變化(如色氨酸(Trp)熒光猝滅[8]、總熒光產物及脂褐素含量增加等)[8,11]。Israni等[12]發現訶子水提物能有效降低高血脂大鼠體內低密度脂蛋白含量。

本實驗室前期研究表明,訶子在國家公布的114種可用于保健食品原料中抗氧化活性高居第一[13];劉仁綠等[14]進一步發現,訶子粗提物(the crude extracts of Terminalia chebula Retz,CET)對LDL所含脂類成分在氧化過程中TBARS的產生具有顯著的抑制作用,且不同極性部位抑制作用差異明顯,乙酸乙酯相為其有效部位。但是,訶子對LDL所含蛋白成分(apoB100)氧化的抑制能力及其抑制LDL蛋白組分氧化過程熒光特性改變的功效目前均不清楚。

因此,在實驗室前期研究訶子抗氧化、抑制LDL脂類成分氧化的工作基礎上,本文采用熒光光譜學技術進一步檢測TCR抑制LDL所含蛋白氧化的抑制效果,以期為后續相關功能食品研發提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

訶子 產地廣西,購自湖南長沙君昊中藥飲片科貿有限公司,買回后立即粉碎干燥、過50目篩后置入冰箱中備用;LDL從健康人體血漿中分離得到;肝素鈉(185 U/mg) 上海阿拉丁生化科技股份有限公司;2,4,6-三硝基苯磺酸(2,4,6-Trinitrobenzenesulfonic acid solution,TNBS) 成都格雷西亞化學技術有限公司;其它試劑 均為國產分析純或優級純。

LS-55熒光/磷光/發光分光光度計 美國Perkin Elmer公司;PB-10型pH計 Sartorius儀器設備有限公司;DFY-C型高速粉碎機 溫嶺林大機械有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 訶子粗提物及乙酸乙酯相制備 根據江慎華等[1]采用的生物活性追蹤法制備得到訶子粗提物及乙酸乙酯相(the ethyl acetate fraction of Terminalia chebula Retz,EAFT)。稱取160 g訶子干粉,采用50%乙醇、料液比1∶20 (g∶mL)、60 ℃提取4次,每次提取7 min,最后將提取液合并。取1/10作為粗提液,濃縮、凍干后得到CET。剩余9/10提取液濃縮后加入一定體積的蒸餾水制成懸濁液,分別采用極性逐漸增大的正己烷、乙酸乙酯和正丁醇依次萃取,最后剩余水相部位。其中,乙酸乙酯萃取液濃縮、凍干后得到EAFT,采用甲醇配制成不同濃度樣液備用。

1.2.2 LDL制備 采用劉仁綠[14]、Wieland等[15]和Yang等[5]方法。取血漿300 mL,加入沉淀液3000 mL(肝素鈉濃度50000 U/L,0.064 mol/L檸檬酸三鈉,5 mol/L鹽酸調pH至5.04),混合均勻,磁力攪拌30 s,37 ℃水浴15 min后于4 ℃、3000 r/min離心10 min,棄上清液獲得沉淀物,向沉淀中加入1500 mL洗滌液(0.064 mol/L檸檬酸鈉,pH=5.11)溶解洗滌后于4 ℃、3000 r/min離心10 min,所得沉淀用160 g/L NaCl、8.1 mol/L Na2HPO4·12H2O、1.5 mol/L KH2PO4、2.7 mol/L KCl、pH7.4的高鹽磷酸鹽緩沖液將上述沉淀溶解,冰箱中避光透析24 h,每6 h換一次透析液。以牛血清白蛋白為標準品,采用Lowry法測定蛋白濃度來表示LDL濃度,所需各種LDL濃度用高鹽PBS稀釋、4 ℃避光保存并3 d內用完。

1.2.3 訶子對LDL中apoB100氧化修飾的抑制效果 空白指未添加氧化劑CuSO4,分別以相同體積去離子水和甲醇代替CuSO4和訶子樣液;促氧指添加氧化劑CuSO4,以相同體積甲醇代替訶子樣液;陽性對照指以2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(2,6-Di-Tert-Butyl-4-Methylphenol,BHT)來代替訶子樣液,以上樣品其它操作均相同。以下各濃度均為混合體系中的終濃度。

1.2.3.1 對apoB100中Lys游離氨基活性降低的抑制效果 定量測定抑制效果:運用TNBS活性法[16],略作修改。取濃度750 μg/mL的LDL 9.8 mL,加 0.1 mL CuSO4或者去離子水,再加0.1 mL不同濃度樣液(樣液濃度分別為1.25、2.5、5 μg/mL)或甲醇,37 ℃恒溫孵育氧化24 h后,取1 mL體系混合液與1 mL 4% NaCHCO3混勻,加50 μL 0.1% TNBS溶液,37 ℃孵育1 h后在340 nm處測定吸光度值。

采用此方法對CET及EAFT的抑制效果進行測定。

定性測定抑制效果:按照Picard等[17]和Yang等[5]方法,分別固定激發波長Ex 350 nm、掃描發射波長范圍Em 400～550 nm和固定激發波長Ex 390 nm、掃描發射波長范圍Em 400～550 nm來掃描LDL在氧化過程中產生的活性醛及MDA修飾Lys殘基熒光變化情況。

1.2.3.2 對LDL中apoB100中色氨酸(Trp)熒光猝滅的抑制效果 定量測定抑制效果:采用Chen 等[18]方法,略作修改。取4.9 mL 500 μg/mL LDL溶液,加50 μL 1.25 μmol/L CuSO4或去離子水,再加50 μL不同濃度樣液(樣液濃度分別為5、10、15 μg/mL)或甲醇,37 ℃恒溫水浴孵育氧化18 h后在Ex295/Em330 nm測定熒光強度。

定性測定抑制效果:采用Yang等[5]方法,略作修改。按照上述1.2.3.1的方法孵育,固定激發波長(Ex)280 nm,掃描發射波長(Em)(300～450) nm來掃描LDL氧化過程中Trp熒光猝滅的效果。

1.2.3.3 對apoB100在氧化過程中總熒光產生的抑制效果 采用Yang等[5]方法,按照1.2.3.1方法孵育反應體系,在Ex360/Em 430 nm處測定熒光強度以評價抑制效果。

1.2.3.4 對apoB100在氧化過程中脂褐素產生的抑制效果 采用Yang等[5]、謝志勇等[19]方法,按照1.2.3.1方法孵育反應體系,在Ex350/Em 460 nm處測定LDL氧化產生脂褐素的熒光強度。

1.2.3.5 對apoB100在氧化過程中三維熒光產生的抑制效果 運用曾鈞杰等[8]和Mclean等[20]方法,按照1.2.3.1(1)方法孵育反應體系,設定Ex(200～420 nm)、Em(260～500 nm)狹縫寬度均為15 nm及光譜間隔10 nm進行三維熒光掃描,獲得三維熒光等高線圖來評價EAFT對apoB100氧化過程中熒光變化的抑制效果。

1.3 數據處理

所有相關試驗及測定均進行3次重復,采用DPS數據分析軟件進行顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 CET對apoB100中Lys游離氨基活性降低的抑制效果

為了驗證訶子對LDL氧化過程中apoB100熒光改變的抑制效果,本文首先對CET的抑制作用進行了測定與分析。Lys游離氨基與TNBS反應形成的復合物在340 nm處有吸收,通過測定Lys氨基活性程度可反映出LDL氧化修飾程度,吸光度值越高表示氧化程度越低[16]。本文首先采用1.2.3.1方法測得CET對apoB100氧化修飾的抑制效果如圖1所示。從圖1可看出,當CET濃度為1.25和2.5 μg/mL時,OD340值分別為0.228和0.319,分別比促氧組(OD340值為0.216)高出5.56%、47.69%,與同濃度的BHT組相比略低,但均顯著大于促氧組(P<0.05)。而當CET濃度為5 μg/mL時,OD340值甚至顯著大于空白組(OD340值為0.393)(P<0.05),表明CET能顯著抑制LDL所含蛋白組分氧化,這可能是由于粗提物中所含的有效成分能夠保護Lys殘基不受氧化修飾。實驗室前期研究也發現丁香粗提物中有效成分也能保護Lys殘基不被氧化修飾[8]。

圖1 CET對賴氨酸游離氨基酸活性降低的抑制作用Fig.1 Inhibition effect of CETon reactivity decrease of free amino in Lysine注:圖中不同小寫字母表示各樣品抑制效果具有顯著性差異(P<0.05);圖2、圖5同。

上述測定結果表明,CET對apoB100氧化過程具有很強的抑制效果。實驗室前期研究發現,EAFT在訶子不同極性部位(正己烷相、乙酸乙酯相、正丁醇相、水相)中抗氧化能力最強,為其抗氧化有效部位[13];同時又發現EAFT對LDL所含脂類氧化具有顯著的抑制效果[14]。因此,本文在此基礎上進一步采用熒光技術對EAFT抑制LDL所含蛋白apoB100的氧化效果進行了分析與測定。

2.2 EAFT對LDL所含蛋白(apoB100)氧化修飾的抑制作用

2.2.1 EAFT對apoB100中Lys游離氨基活性降低的抑制效果

2.1.2.1 抑制效果定量測定 LDL中脂質組分發生氧化時產生大量包括活性醛(如MDA)在內的過氧化物,這些活性醛都會與LDL上所含Lys殘基結合導致活性降低并最終形成[5]動脈粥樣硬化[4]。通過測定Lys氨基活性程度可反映出LDL氧化修飾程度[16]。

按照1.2.3.1方法測定EAFT對LDL氧化過程中Lys游離氨基活性的測定結果如圖2所示。從圖2可看出,EAFT在1.25～5.0 μg/mL濃度范圍內,對LDL氧化過程中的Lys游離氨基減少具有很強的抑制效果。隨著濃度升高、抑制效果更強。盡管其抑制效果均弱于陽性對照BHT,但當濃度達2.5 μg/mL以上,其Lys游離氨基的活性顯著高于空白組(P<0.05),這充分表明EAFT能有效抑制LDL氧化過程中Lys氧化修飾。

圖2 EAFT對Lys游離氨基酸活性降低的抑制作用Fig.2 Inhibition effect of EAFTon in reactivity decrease of free amino in Lysine

2.1.2.2 抑制效果定性測定 LDL脂質組分氧化產生的活性醛及MDA與LDL上所含Lys殘基結合形成的希夫堿分別在Ex 350 nm/Em 420 nm、Ex 390 nm/Em 460 nm有很強的熒光吸收,熒光強度越強表示氧化程度越高。由此采用熒光掃描光譜可衡量樣液對LDL脂質氧化產物活性醛對apoB100中Lys殘基的氧化修飾程度[17],測得結果如圖3～圖4所示。

從圖3、圖4可知,促氧組熒光強度最高,空白組熒光強度最低,表示LDL中脂質過氧化產生的活性醛與Lys殘基結合,增強了熒光吸收。當添加不同濃度樣液后,熒光強度隨EAFT濃度升高而降低,說明EAFT能很好地抑制LDL氧化過程中產生的活性醛修飾Lys殘基。Picard等[17]也發現氨基胍能抑制活性醛和MDA修飾apoB100所含的Lys殘基。

圖3 EAFT對活性醛修飾Lys殘基熒光改變的抑制Fig.3 Inhibition effect of EAFT on fluorescence spectrachange of Lys residue modified by reactive aldehydesa:促氧;b:1.25 μg/mL EAFT;c:2.5 μg/mL EAFT;d:5 μg/mL EAFT;e:BHT;f:空白。

圖4 EAFT對MDA修飾Lys殘基熒光改變的抑制Fig.4 Inhibition effect of EAFT on fluorescencespectra change of Lys residue modified by MDA注:a:促氧;b:1.25 μg/mL EAFT;c:2.5 μg/mL EAFT;d:5 μg/mL EAFT;e:BHT;f:空白。

2.2.2 EAFT對LDL所含apoB100中Trp氧化修飾的抑制作用 apoB100內所含的Trp在Cu2+介導作用下,在氧化延遲階段易被氧化修飾、導致Trp殘基減少[5]。而Trp是LDL主要的內在熒光團,當LDL被氧化后其熒光會發生猝滅,通過測定Trp熒光猝滅程度可反映LDL被氧化修飾程度,熒光強度越強表示氧化程度越低[21]。

2.2.2.1 定量測定對Trp熒光猝滅的抑制效果 采用1.2.3.1方法孵育反應體系測定結果如圖5所示。從該圖可看出,當EAFT濃度為5、10、15 μg/mL時,熒光強度分別為180.67、187.79、197.65,熒光強度與EAFT濃度呈正相關,而促氧組熒光強度僅為133.15,顯著小于添加EAFT的樣品組(P<0.05),表明EAFT能很好抑制Trp殘基熒光猝滅、可有效防止LDL氧化。曾鈞杰等[8]發現丁香中含有多酚,能夠清除自由基、螯合過度金屬離子,從而抑制Trp熒光猝滅。孟和阿木古浪等[22]也發現訶子中含有大量多酚類物質。因此,訶子可能也是通過其高含量的多酚類化合物實現對Trp熒光猝滅的抑制功效。

圖5 定量測定EAFT對Trp熒光淬滅的抑制效果Fig.5 Inhibition effect of EAFTon Trp fluorescence quenching by quantitative determination

2.2.2.2 定性測定對Trp熒光猝滅的抑制效果 為了更直觀地驗證EAFT的抑制效果,本實驗在2.1.1(1)基礎上在Ex280 nm處激發、發射波長范圍300～450 nm條件下進行熒光掃描,其結果如圖6所示。從該圖可看出,所有樣品均在340 nm處有最大熒光吸收。與促氧組相比,空白組、BHT組和EAFT各濃度在340 nm處熒光吸收強度均更高、且與濃度成正比關系,與上圖5中所測結果相一致。萬嚴等[21]也發現丁香乙酸乙酯相也能有效抑制LDL氧化過程中Trp降解。

圖6 定性測定EAFT對Trp熒光淬滅的抑制效果Fig.6 Inhibition effect of EAFTon Trp fluorescence quenching by qualitative determination注:a:促氧,b:15 μg/mLBHT,c:10 μg/mL BHT,d:5 μg/mL BHT,e:15 μg/mL EAFT,f:10 μg/mL EAFT,g:5 μg/ml EAFT,h:空白。

2.2.3 EAFT對LDL中apoB100在氧化過程中總熒光產生的抑制效果 據報道,天然LDL(native LDL,n-LDL)在Ex 360/Em430 nm處有微弱熒光吸收[5]。當LDL被氧化修飾后會形成在Ex360/Em 430 nm處有強熒光吸收的總熒光物質[8],熒光強度越強表示氧化程度越高[23]。在上述測定基礎上,進一步對EAFT抑制總熒光產物產生的效果進行了檢測。

按照上述1.2.3.3方法測定各樣品總熒光產物的結果如圖7所示。從該圖可知,促氧熒光強度最高。添加不同濃度(5～15 μg/mL)EAFT樣液后,盡管高于相同濃度的BHT,但與促氧樣品的熒光強度(189.39)相比,其總熒光強度分別降低了48.88%、49.85%及59.15%,均極顯著低于促氧(P<0.01),表明EAFT能有效抑制LDL氧化過程中總熒光產物的生成。Yang等[5]也發現丁香中乙酸乙酯相也能很好地抑制LDL氧化過程中總熒光產物的生成。Mclean等[20]也發現普羅布考(一種合成藥)能減緩ox-LDL熒光產物的增加速率。

表1 EAFT對LDL三維熒光光譜改變的抑制效果Table 1 Inhibition effect of EAFT on the change of three-dimensional fluorescence contour spectroscopy during LDL oxidation

圖7 EAFT對總熒光產物產生的抑制效果Fig.7 Inhibition effect of EAFTon production oftotal fluorescence注:圖中不同小寫字母表示各樣品抑制效果具有顯著性差異(P<0.05);圖8同。

2.2.4 EAFT對LDL中apoB100在氧化過程中脂褐素產生的抑制效果 脂褐素是人體內衰老的指標,通過測量脂褐素的含量可反映出細胞被自由基損傷的程度[8]。在LDL氧化期間也生成脂褐素。因此,在測定對總熒光產物抑制的基礎上,本試驗進一步對EAFT抑制脂褐素的產生效果進行了測定。

按照上述1.2.3.3方法測得結果如圖8所示。從圖中可知,促氧組熒光強度(137.55)最高、脂褐素產生量最多,比空白組熒光強度(46.915)高出了193.1%。添加不同濃度EAFT樣液(5、10、15 μg/mL)后,熒光強度及脂褐素含量雖均高于BHT組但均顯著低于促氧組(P<0.01),且樣液濃度越高、脂褐素產生量越低,表明EAFT對LDL氧化過程中脂褐素的生成具有顯著抑制作用(P<0.01),進一步驗證明了其對LDL氧化的抑制效果。王麗麗等[10]也發現丁香葉提取物也能抑制脂褐素生成。

圖8 EAFT對脂褐素產生的抑制效果Fig.8 Inhibition effect of EAFT on production oflipofuscins

2.2.5 EAFT對LDL中apoB100氧化過程中三維熒光光譜改變的抑制效果 在上述采用傳統熒光技術發現EAFT對LDL所含蛋白氧化均有較好抑制效果的基礎上,本文進一步采用三維熒光等高線譜直觀表征其抑制效果,結果如圖9及表1所示。其中,Peak A(Ex340/Em280 nm)處熒光強度表示天然LDL原始熒光信號,為Trp內源吸收峰[10],其信號越強代表氧化程度越低。而Peak B(Ex440/Em360 nm)處熒光強度表示LDL經氧化生成的新熒光產物,其信號越強代表氧化程度越高[8,24]。

從圖9(a)及表1可知,空白組Peak A處熒光強度最高(990),LDL原始熒光信號完整,表示LDL未被氧化修飾[19]。當n-LDL被氧化成ox-LDL后(圖9(b)),Peak A處熒光信號由n-LDL的990降低到ox-LDL的256.97,Peak B處新生成的熒光產物從n-LDL的73.55增加到ox-LDL的256.97。從圖9(d)～圖9(f)可知,當添加不同濃度的EAFT(5、10及15 μg/mL)樣液后,與ox-LDL相比,Peak A處的熒光強度減弱程度得到有效抑制,其強度從ox-LDL的256.97分別增加到426.83、513.95、及538.6(圖9、表1);而Peak B處熒光產物的生成也受到顯著抑制,其強度從ox-LDL的256.97分別降低到130.01、138.64及128.23,進一步直觀地表明了EAFT能有效抑制LDL氧化修飾。曾鈞杰等[8]、張小霞等[24]也發現丁香乙酸乙酯相能有效抑制LDL氧化修飾,與本試驗結果類似。

3 結論

本文首先發現訶子粗提物CET能有效抑制LDL所含蛋白apoB100中Lys游離氨基活性降低,體現出CET對LDL所含蛋白氧化的抑制效果。在此基礎上,本實驗進一步發現訶子抗氧化有效部位EAFT能有效抑制LDL所含蛋白apoB 100Trp熒光淬滅、總熒光產物及脂褐素的產生,也能抑制LDL氧化過程中三維熒光光譜的改變,抑制效果均呈現出較好的量效關系。本文結果為后續對EAFT組成成分分析及所含各種有效成分分離純化提供參考。