煮制過(guò)程中食鹽引起肉湯成分含量變化的研究

諸瓊妞,2,祝超智,*,趙改名,張秋會(huì),崔文明

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院,河南鄭州 450002;2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院,江蘇南京 210095)

豬肉湯僅滋味甚好,且溶于水中的營(yíng)養(yǎng)成分較多,含有豐富的短肽、氨基酸、脂肪酸、骨膠類物質(zhì)以及礦物質(zhì)元素等,易被人體吸收和利用[1]。根據(jù)湯的色澤可分為白湯、清湯和素湯[2]。白湯經(jīng)加工后,色澤乳白,煮制過(guò)程中不添加食鹽[2]。清湯湯汁澄清,以豬肉、豬骨等為原料煮制而成,加入食鹽等調(diào)味料,煮制的湯就變成了透明的清湯,口味鮮濃[3]。加入食鹽后,肉湯中原來(lái)的乳化體系被打破,煮制的白湯變成了清湯。

在食品加工過(guò)程中添加一定濃度鹽是必須的[4]。在肉湯煮制過(guò)程中添加食鹽,鈉離子可提供咸味,氯離子促使肌原纖維蛋白溶解并對(duì)咸味起到修飾,從而發(fā)揮其加工特性[5]。肉中的蛋白質(zhì)不能直接被人體內(nèi)利用,而是轉(zhuǎn)變?yōu)榘被嵝》肿雍蟊晃铡Ｍㄟ^(guò)燉或煮的方法,將肉蛋白水解為易被利用的氨基酸而更有利于人體的吸收。煮制過(guò)程中食鹽的添加,會(huì)改變肌原纖維蛋白的結(jié)構(gòu),尤其是肌球蛋白的提取率、完整性[6],進(jìn)而影響蛋白質(zhì)的功能特性及降解途徑。另外,不飽和脂肪酸尤其是多不飽和脂肪酸對(duì)熱不穩(wěn)定,加鹽與無(wú)鹽肉湯都需經(jīng)過(guò)高溫煮制,這對(duì)于不飽和脂肪酸有一定的破壞作用,而食鹽能在一定程度上防止氧化,提高肉湯的保水保油性能和貨架期等[7],影響了食用品質(zhì)。

隨著人們對(duì)加工類肉制品需求量的不斷增加及對(duì)肉制品營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)要求的不斷提高,對(duì)加工過(guò)程中食品成分的相互作用以及對(duì)產(chǎn)品品質(zhì)、營(yíng)養(yǎng)特性影響的研究越來(lái)越迫切。本文研究食鹽對(duì)肉湯煮制過(guò)程中蛋白質(zhì)及其降解物、脂肪及脂肪酸含量的差異變化。不僅明確了造成肉湯差異化的主要原因,也為食鹽對(duì)肉制品營(yíng)養(yǎng)及風(fēng)味的影響提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

冷鮮豬肉(帶皮里脊) 產(chǎn)于開封市福生祥食業(yè)有限公司,購(gòu)于鄭州市花園路拜特超市;食鹽(食用級(jí)) 鄭州市文化路丹尼斯超市;BCA法測(cè)定蛋白濃度試劑盒 上海生工生物工程股份有限公司;預(yù)染彩虹廣譜蛋白Marker(ColorMixed Protein Marker range 11-245 KD) 北京索萊寶科技有限公司;AccQ·Tag氨基酸試劑包 美國(guó)Waters公司;37種脂肪酸甲酯混標(biāo) 美國(guó)Supelco公司;無(wú)水乙醚、三氯乙酸、氯仿等均為國(guó)產(chǎn)分析純,正己烷(色譜純) 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;氮?dú)?河南迎眾化工產(chǎn)品有限公司。

T10 ULTRA-TURRAX高速分散器 德國(guó)IKA;MULTISKAN GO酶標(biāo)儀 上海賽默生物科技發(fā)展有限公司;24 DN制膠器 北京市六一儀器廠;DYY-5型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀 北京市六一儀器廠;Upland,CA凝膠成像系統(tǒng) 美國(guó)UVP公司;ALLEGRA-64A高速冷凍離心機(jī) 鄭州美生商貿(mào)有限公司;ZF-06A脂肪測(cè)定儀 上海瑞正儀器設(shè)備有限公司;K1301半自動(dòng)凱氏定氮儀 上海晟生有限公司;GC-2010氣相色譜儀(配有氫火焰檢測(cè)器(FID)及數(shù)據(jù)分析工作站) 日本島津公司;Waters2695高效液相色譜儀(配有二極管檢測(cè)器、717plus自動(dòng)進(jìn)樣器及數(shù)據(jù)分析工作站) 美國(guó)Waters公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 豬肉湯的制備 將帶皮里脊去除表皮、筋腱、淋巴、血管等,清水浸泡,去除血污,瀝干,把肥、瘦肉切分開,按照肥瘦比為3∶7分成兩份,保持水溫90 ℃以上焯5 min,撇去浮沫和臟污,撈出冷涼并分別將肥、瘦肉切割成2 cm×1 cm×1 cm的塊狀,以肉∶清水比1∶1.5,(w/w)的比例[8]煮制。加鹽組清水中加入水重2%的食鹽,無(wú)鹽組直接用清水煮制。兩組處理均先用不銹鋼鍋大火煮制15 min,條件為1600 W,210 ℃,隨后小火煮制2 h,條件為120 W,70 ℃。分別在小火煮制過(guò)程的30,60,90,120 min時(shí)取樣。制樣品時(shí)將肉湯用單層紗布過(guò)濾,無(wú)明顯大顆粒存留。

1.2.2 樣品中粗蛋白含量的測(cè)定 吸取樣品20 mL(精確到0.1 mL以下同)于離心管中,采用馮志明[9]的方法并略作修改,經(jīng)過(guò)3500 r/min,4 ℃離心10 min后,參照BCA法蛋白質(zhì)濃度測(cè)定。選取酶標(biāo)板上40個(gè)孔,分為標(biāo)準(zhǔn)組和樣品組。其中16個(gè)孔,每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品設(shè)置1個(gè)重復(fù),各孔分別加入20 μL相應(yīng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液;剩余24個(gè)孔,分為3個(gè)平行組,平行孔編號(hào)相同,其中編號(hào)不同的8個(gè)孔加入濃度不同的20 μL樣品稀釋液。再向各酶標(biāo)孔加入200 μL BCA工作液,迅速混勻。在37 ℃水浴中保溫30 min,冷卻至室溫后,在酶標(biāo)儀上測(cè)各孔的A562 nm值。以標(biāo)準(zhǔn)組各孔A562 nm平均值為縱坐標(biāo),對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)三個(gè)相同樣品稀釋液A562 nm值的平均值,在標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出該樣品經(jīng)過(guò)稀釋后的蛋白質(zhì)濃度,選擇合適稀釋度的樣品計(jì)算最終的樣品蛋白濃度,再由稀釋倍數(shù)計(jì)算原樣品粗蛋白濃度。

1.2.3 樣品中非蛋白總氮含量的測(cè)定 吸取樣品20 mL(精確到0.1 mL)于燒杯中,采用趙改名等[10]的方法,加入150 g/L三氯乙酸溶液(或15%)20 mL,漩渦混勻1 min以充分沉淀蛋白,于4 ℃冰箱里放置過(guò)夜,次日2500×g離心10 min后取濾液,移取10 mL濾液,參照微量凱氏定氮法測(cè)定非蛋白氮含量[11]。

1.2.4 樣品中可溶性蛋白氮含量的測(cè)定 吸取樣品20 mL(精確到0.1 mL)于燒杯中,采用趙改名等[10]的方法,加入70 mL緩沖液(50 mmol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液,pH6.0),在冰浴中高速勻漿1次(22000 r/min),在4 ℃冰箱里放置2 h,12000×g,4 ℃離心15 min,中速濾紙過(guò)濾后,用緩沖液定容至100 mL。按照測(cè)定粗蛋白含量方法,參照BCA法蛋白質(zhì)濃度測(cè)定。

1.2.5 樣品中鹽溶性蛋白含量的測(cè)定 吸取樣品10 mL(精確到0.1 mL)于燒杯中,采用劉野[12]的方法并略作修改,加入80 mL NaCl(0.8 mol/L)溶液,10 mL MgCl2(0.04 mol/L)溶液,用Na2HPO4和NaH2PO4(4 g/kg)粉末,用玻璃棒攪拌10 min,調(diào)整pH為7,用高速分散器最低轉(zhuǎn)速下勻漿3 min后,上清液用四層紗布過(guò)濾,所得濾液即為肉湯鹽溶性蛋白粗提液,參照BCA法蛋白質(zhì)濃度測(cè)定。

1.2.6 樣品蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量的測(cè)定 以分子量范圍為11～245 kDa,采用SDS-PAGE分析食鹽的添加對(duì)煮制過(guò)程中肉湯成分的全蛋白的降解情況,參照黃體冉等[13]的方法并略作修改,制膠的分離膠濃度為15%(4.6 mL水,10 mL 30%丙烯酰胺溶液,5 mL 1.5 mol/L Tris(pH8.8),0.2 mL 10% SDS,0.2 mL 10%過(guò)硫酸銨,8 μL 0.05% TEMED),濃縮膠濃度為5%(6.8 mL水,1.66 mL 30%丙烯酰胺溶液,1.26 mL 1.5 mol/L Tris(pH6.8),0.1 mL 10% SDS,0.1 mL 10%過(guò)硫酸銨,10 μL 0.05% TEMED)。先將10 mL樣品離心取上層清液,按30 μL上清液加入10 μL 上樣緩沖液的比例混勻后,100 ℃水浴加熱10 min,使蛋白變性。冷卻至室溫后,離心12000 r/min,5 min,取上清液10 μL直接上樣電泳。樣品進(jìn)入凝膠以后,在濃縮膠時(shí),將電壓調(diào)至80 V,保持電壓強(qiáng)度不變,在分離膠時(shí),再將電壓調(diào)至120 V,保持電壓強(qiáng)度不變。電泳結(jié)束后,準(zhǔn)備好染色用的培養(yǎng)皿,用水緩慢將凝膠從玻璃板上脫離。在培養(yǎng)皿內(nèi)加入考馬斯亮藍(lán)R-250染色液,充分混勻,浸泡4 h以上。染色完畢,傾出染色液,用蒸餾水沖洗后將凝膠置于脫色液中,脫色4～8 h,其間更換脫色液2～3次。

注:同一列不同大寫字母表示同一加鹽量不同煮制時(shí)間下豬肉湯各指標(biāo)的差異顯著(P<0.05);同列不同小寫字母表示加鹽與無(wú)鹽豬肉湯各指標(biāo)的差異顯著(P<0.05);表2～表5、圖2、圖4 同。

1.2.7 樣品中氨基酸含量及成分的測(cè)定 利用高效液相色譜儀,柱前衍生進(jìn)行氨基酸分析測(cè)定。參照顧偉鋼[14]和高向陽(yáng)[15]的方法并略作修改,精確吸取樣品5 mL(精確到0.1 mL),與鹽酸按體積比1∶1加入水解管中,110 ℃水解24 h,冷卻后,超純水洗滌三次,用氫氧化鈉溶液調(diào)pH至9.0左右,用超純水定容至50 mL容量瓶中。色譜條件:色譜柱:Ultimate Amino acid,4.6 mm×250 mm,5 μm,;流動(dòng)相A:V(醋酸鈉溶液)∶V(乙腈)=93∶7,流動(dòng)相B:V(水)∶V(乙腈)=20∶80,其中醋酸鈉溶液用冰醋酸調(diào)節(jié)pH6.5(流動(dòng)相A配好的醋酸鈉需先調(diào)節(jié)pH到6.5,再按照上述比例加入乙腈進(jìn)行抽濾),流動(dòng)相梯度洗脫;柱溫:37 ℃;流速:1 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng):254 nm;進(jìn)樣量:5 μL。

1.2.8 樣品中脂肪含量的測(cè)定 吸取樣品20 mL(精確到0.1 mL),置于鋁盒中,加入海砂約10 g,攪勻后先在95～105 ℃的烘箱中烘6 h直至恒重[16]。參照GB 5009.6-2016食品中脂肪的測(cè)定,以無(wú)水乙醚為萃取劑采用索氏提取器進(jìn)行抽提[17]。

1.2.9 樣品中脂肪酸含量及成分的測(cè)定 吸取樣品5 mL(精確到0.1 mL)于50 mL離心管中,參照瞿明勇[1]的方法,用氮吹至出現(xiàn)黃白色固體。再用正己烷進(jìn)行甲酯化。取上清液進(jìn)行GC分析。色譜柱:DB-WAX(60 m×0.53 mm×1 μm);分流進(jìn)樣,分流比為1;載氣控制方式:線速率36 cm/sec;SPL:250 ℃;FID:280;柱箱溫度:50.0 ℃為初始溫度,保留1.00 min;25.00 ℃/min升至200.0 ℃不保留;3.00 ℃/min升至230.0 ℃保留50.00 min。

1.2.10 樣品蛋白水解指數(shù)(PI)計(jì)算 公式如下[18]。

式中:A為樣品總氮含量;B為樣品非蛋白氮含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每組試驗(yàn)重復(fù)三次,試驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示測(cè)定結(jié)果,采用Excel 2007和SPSS 13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。采用ANOVA對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異分析,P<0.05為顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 加鹽與無(wú)鹽豬肉湯煮制過(guò)程中蛋白含量的變化

由表1可知,食鹽的添加使豬肉湯中粗蛋白、非蛋白總氮、可溶性蛋白、鹽溶性蛋白和蛋白質(zhì)水解指數(shù)均顯著增加(P<0.05)。加鹽肉湯煮制過(guò)程中,粗蛋白與可溶性蛋白氮含量持續(xù)上升,且在煮制90 min時(shí),其含量與無(wú)鹽肉湯的差值最大。在煮制60～90 min期間,無(wú)鹽肉湯中蛋白質(zhì)降解反應(yīng)最劇烈,90 min后水解指數(shù)趨于穩(wěn)定,其蛋白質(zhì)水解程度始終弱于加鹽肉湯。非蛋白氮是表征蛋白質(zhì)降解的一個(gè)指標(biāo)[19],煮制時(shí)間對(duì)無(wú)鹽肉湯中非蛋白總氮含量有顯著性影響(P<0.05)。加鹽肉湯的鹽溶性蛋白含量高于無(wú)鹽肉湯,肌肉蛋白在鹽溶液中溶解是一個(gè)重要的物化過(guò)程,肉中的大部分蛋白質(zhì)為水不溶性蛋白質(zhì)[20],隨著肉湯中食鹽濃度增加,且每煮制30 min,鹽溶性蛋白含量約增加0.6 mg/mL,隨著肉湯中食鹽濃度增加,蛋白質(zhì)溶解到水相中,浸提出大量鹽溶性蛋白質(zhì),從而肌原纖維吸水膨脹[21],與肉制品的加工特性如凝膠性、保水性等有密切關(guān)系,直接影響最終產(chǎn)品的食用品質(zhì)[22]。

2.2 加鹽與無(wú)鹽豬肉湯煮制過(guò)程中脂肪含量的變化

由表2可知,煮制時(shí)間對(duì)肉湯中粗脂肪含量有顯著性影響(P<0.05),長(zhǎng)時(shí)間的煮制有利于脂肪從肌肉中析出。食鹽的添加使肉湯的脂肪含量顯著增加(P<0.05),煮制30 min時(shí)加鹽與無(wú)鹽肉湯的脂肪含量差值較小,到煮制120 min時(shí),加鹽肉湯脂肪含量比無(wú)鹽肉湯多了3.193 mg/mL,差值增加了5倍。且加鹽肉湯在煮制90 min時(shí)的脂肪含量就達(dá)到了無(wú)鹽肉湯煮制120 min時(shí)的脂肪含量。

表2 加鹽與無(wú)鹽豬肉湯煮制過(guò)程中的脂肪含量Tab1e 2 Fat contents in pork broth withor without salt at different cooking times

2.3 SDS-PAGE凝膠電泳

SDS-PAGE凝膠電泳圖譜顯示煮制過(guò)程中大分子蛋白降解明顯。由圖1可知,無(wú)鹽肉湯中分子量主要集中在135～245 kDa;而加鹽肉湯中分子量主要集中在35～48 kDa,還含有17～25 kDa的低分子蛋白條帶。加鹽肉湯中低分子量蛋白條帶更多,這說(shuō)明食鹽的添加使大分子蛋白降解成小分子蛋白。并且隨著煮制時(shí)間的增加,蛋白條帶變多且顏色加深,說(shuō)明蛋白水解更徹底。

圖1 不同煮制時(shí)間下加鹽與無(wú)鹽豬肉湯中全蛋白SDS-PAGE凝膠電泳圖Fig.1 SDS-PAGE profile of whole proteinin pork broth with or without salt at different cooking times

2.4 加鹽與無(wú)鹽豬肉湯中水解氨基酸含量及組成的變化

由表3可知,在煮制過(guò)程中,食鹽的添加使肉湯中水解氨基酸總含量顯著增加(P<0.05),與前面對(duì)肉湯中粗蛋白含量的測(cè)定結(jié)果趨勢(shì)一致。由圖2可知,在煮制120 min時(shí),食鹽的添加對(duì)肉湯中Glu、Gly、His、Arg、Pro、Tyr、Leu含量有顯著性影響(P<0.05)。加鹽肉湯的Glu、Gly、His、Tyr等含量顯著高于無(wú)鹽肉湯,特別是加鹽肉湯的His含量較高,其對(duì)于嬰幼兒的成長(zhǎng)尤為重要。食品中營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的高低主要由蛋白質(zhì)中氨基酸的含量、組成及比例決定[23],在煮制過(guò)程中,各種氨基酸成分含量呈上升趨勢(shì),且加鹽肉湯的必需氨基酸及總量均高于無(wú)鹽肉湯,故加鹽肉湯的營(yíng)養(yǎng)成分能更好地被人體吸收利用。

表3 加鹽與無(wú)鹽豬肉湯煮制過(guò)程中的水解氨基酸總含量Table 3 Contents of hydrolyzed amino acids in pork brothwith or without salt at different cooking times

圖2 煮制120 min時(shí)豬肉湯中的水解氨基酸含量及成分Fig.2 Contents and composition of hydrolyzedamino acids in pork broth for 120 minutes

2.5 加鹽與無(wú)鹽豬肉湯中游離氨基酸含量及組成的變化

氨基酸多以結(jié)合形式存在于蛋白質(zhì)中,以自由態(tài)存在的游離氨基酸是由氨肽酶對(duì)肽類的分解而產(chǎn)生的[24],其可以通過(guò)和脂類發(fā)生的氧化反應(yīng),促進(jìn)滋味產(chǎn)生,形成風(fēng)味物質(zhì)[25],一般把谷氨酸、天冬氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、甘氨酸和酪氨酸這6種能呈現(xiàn)出特殊鮮味的氨基酸稱為呈味氨基酸[26]。由表4可知,在煮制90 min后,加鹽肉湯中游離氨基酸總含量顯著高于無(wú)鹽肉湯(P<0.05),說(shuō)明隨著加熱的進(jìn)行,食鹽可以促進(jìn)游離氨基酸的溶出。由圖3可知,在煮制120 min時(shí),食鹽的添加對(duì)肉湯中Gly、Arg、Thr、Ala、Pro、Tyr、Phe含量有顯著性影響(P<0.05)。Arg在肉湯體系中的含量最多且增加量最大,無(wú)鹽肉湯的Gly、Thr、Ala、Pro等含量均高于加鹽肉湯,故無(wú)鹽肉湯的必需氨基酸和呈味氨基酸均高于加鹽肉湯。

表4 加鹽與無(wú)鹽豬肉湯煮制過(guò)程中的游離氨基酸總含量Table 4 Contents of free amino acids in pork brothwith or without salt at different cooking times

圖3 煮制120 min時(shí)豬肉湯中的游離氨基酸含量及成分Fig.3 Content and composition offree amino acids in pork broth for 120 minutes

2.6 加鹽與無(wú)鹽豬肉湯中主要脂肪酸含量及組成的變化

脂肪酸含量的變化較為復(fù)雜,磷脂或甘油酯水解可以提高脂肪酸含量,但同時(shí)脂肪酸(尤其是不飽和脂肪酸)發(fā)生氧化,會(huì)使脂肪酸含量降低[27]。由表5可知,食鹽的添加使肉湯中脂肪酸總含量顯著增加(P<0.05),與前面肉湯中脂肪含量的測(cè)定結(jié)果趨勢(shì)一致。由圖4可知,在煮制120 min時(shí),食鹽的添加對(duì)肉湯中C16∶0、C16∶1、C18∶0、C18∶1含量均有顯著性影響(P<0.05)。加鹽肉湯中的C18∶1含量顯著高于無(wú)鹽肉湯,C18∶1作為主要單不飽和脂肪酸的一種,故加鹽肉湯的單不飽和脂肪酸含量顯著高于無(wú)鹽肉湯;無(wú)鹽肉湯的C18∶0顯著高于加鹽肉湯,C18∶0作為主要飽和脂肪酸的一種,故無(wú)鹽肉湯中飽和脂肪酸含量高于加鹽肉湯,這可能跟加熱過(guò)程中無(wú)鹽肉湯中不飽和脂肪酸氧化成飽和脂肪酸有關(guān)[1],說(shuō)明食鹽的添加在一定程度上防止不飽和脂肪酸的氧化。煮制120 min時(shí),加鹽肉湯中脂肪酸含量主要由單不飽和脂肪酸組成,達(dá)到52.98%;其次是飽和脂肪酸,占44.71%;多不飽和脂肪酸的含量最低,為2.30%。油酸占單不飽和脂肪酸中比例最高;而多不飽和脂肪酸中亞油酸較高。這與王蒙[28]等對(duì)清燉豬肉湯香氣物質(zhì)分析結(jié)果中一致。

表5 加鹽與無(wú)鹽豬肉湯煮制過(guò)程中的脂肪酸總含量Table 5 Contents of fatty acids in pork brothwith or without salt at different cooking times

圖4 煮制120 min時(shí)豬肉湯中的脂肪酸含量及成分Fig.4 Content and composition offatty acids in pork broth for 120 minutes

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)對(duì)加鹽與無(wú)鹽豬肉湯煮制過(guò)程中的蛋白質(zhì)、脂肪等進(jìn)行了定性與定量分析,驗(yàn)證了食鹽添加對(duì)肉湯成分的影響,不僅為肉湯營(yíng)養(yǎng)及風(fēng)味提供參考,更明確了造成肉湯差異化的主要原因。在不同煮制時(shí)間下,加鹽肉湯中粗蛋白含量、可溶性蛋白含量、非蛋白氮含量、鹽溶性蛋白含量、脂肪含量、氨基酸總含量、脂肪酸總含量均高于無(wú)鹽肉湯。SDS-PAGE凝膠電泳圖譜顯示,食鹽的添加使大分子蛋白降解成小分子蛋白。無(wú)鹽肉湯游離氨基酸中的呈味氨基酸和脂肪酸中的飽和脂肪酸含量均高于加鹽肉湯,故其滋味比加鹽肉湯要鮮美;加鹽肉湯中的氨基酸總含量、脂肪及脂肪酸總含量均高于無(wú)鹽肉湯,且其必需氨基酸比例更高,單不飽和脂肪酸更豐富,更有利于被人體吸收利用,在一定程度上提高了營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)。