超高效液相-串聯質譜法研究銀杏葉提取物提取過程中咖啡因的轉移規律

,2,*,2,2

(1.晨光生物科技集團股份有限公司,河北邯鄲 057250;2.河北省植物天然色素技術研究院,河北邯鄲 057250)

銀杏葉又稱白果葉,具有很高的藥用價值[1-3]。銀杏葉的主要成分是黃酮和銀杏內酯成分,這兩種物質可以有效地降低膽固醇,具有舒張血管、活血化瘀等功效,可用于高血脂、心腦血管、中風偏癱等疾病的治療[4-5]。因此,銀杏葉提取物也成為保健品的重要原料之一。

咖啡因是一種三黃基生物嘌呤堿[6],普遍存在于咖啡豆、茶葉、巧克力、軟飲料等食品中。其主要作用是刺激大腦中樞神經興奮,適度攝入咖啡因可以有效提神醒腦[7-8],用于治療抑郁癥、神經衰弱和昏迷復蘇等,但過度攝入咖啡因容易讓人產生依賴感,引起煩躁、焦慮癥狀,甚至致命[9-11]。咖啡因屬于保健食品中減肥類保健食品中違法添加藥物,因此有效檢測咖啡因含量是對廣大消費者的保障。

目前對于銀杏葉提取物的檢測,主要是針對黃酮和銀杏內酯成分,對其含有的咖啡因檢測極少。檢測咖啡因的常見方法包括高效液相色譜法[12-15]、紫外分光光度計法[16-17]、氣相色譜法[18-19]和氣質聯用法[20-21]。跟上述方法相比,超高效液相色譜-串聯質譜法[22-24]具有靈敏、快捷的優勢。

本文主要采用超高效液相色譜-串聯質譜法檢測銀杏葉、銀杏提取物及其提取過程中間產物中咖啡因含量,研究咖啡因轉移規律,為行業的規范生產提供數據支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

甲醇、乙腈 色譜純,賽默飛世爾科技(中國)有限公司;甲酸 分析純,天津市永達化學試劑有限公司;超純水 實驗室純水機制備;0.2%甲酸溶液、含0.2%甲酸的乙腈、咖啡因(C8H10N4O2,CAS:202282-98-2) 純度≥98%,北京世紀奧科生物技術有限公司;銀杏葉 云南、江蘇邳州、陜西、浙江產地;銀杏葉提取物 市售和自制(工藝路線參照文獻[25]);銀杏葉提取液和銀杏葉渣 自制(工藝路線參照文獻[25])。

Acquity UPLC-TQD超高效液相色譜-串聯質譜儀 沃特世科技(上海)有限公司;KQ-400DB數控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;AUW220電子天平 蘇州華宏儀表有限公司;H-2O50R高速冷凍離心機 長沙湘儀離心機儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 銀杏葉提取物的前處理 準確稱取0.1 g(精確到0.0001)銀杏葉提取物,置于100 mL容量瓶中,加入少量30%甲醇溶液,在溫度為30±0.5 ℃,超聲處理5 min,再用30%甲醇溶液定容至刻度線。根據實際濃度適當稀釋至線性范圍內,過濾膜(0.22 μm),裝小瓶,供高效液相色譜-串聯質譜儀測定。

1.2.2 銀杏葉和銀杏葉渣的前處理 準確稱取1.0 g(精確到0.0001)銀杏葉和銀杏葉渣,置于250 mL錐形瓶中,加入100 mL 30%甲醇溶液超聲1 h,超聲溫度為30±0.5 ℃,根據實際濃度適當稀釋至線性范圍內,用0.22 μm濾膜過濾,裝小瓶,供高效液相色譜-串聯質譜儀測定。

1.2.3 銀杏葉提取液的前處理 準確稱取1.0 g(精確到0.0001)銀杏葉提取液置于50 mL塑料管中,加入10 mL 30%甲醇溶液,在溫度為30±0.5 ℃,超聲處理10 min。根據實際濃度適當稀釋至線性范圍內,用0.22 μm濾膜過濾,裝小瓶,供高效液相色譜-串聯質譜儀測定。

1.2.4 液相色譜條件的優化 流動相采用0.2%甲酸溶液和含0.2%甲酸的乙腈;色譜柱采用ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×50 mm,2.7 μm);進樣量為5 μL;柱溫為30 ℃;流速為0.3 mL/min。通過改變流動相梯度條件,達到最快最優的分離結果。比較了3組流動相梯度洗脫方式Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ,梯度洗脫方式Ⅰ為0～2 min:A=90%,B=10%;2～2.1 min:A由90%變為10%;2.1～4 min:A=10%;4～4.1 min:A由10%變為90%;4.1～5 min:A=90%。梯度洗脫方式Ⅱ為0～5 min:A=95%,B=5%;5～6 min:A由95%變為2%;6～7 min:A=2%;7～7.5 min:A由2%變為95%;7.5～9 min:A=95%。梯度洗脫方式Ⅲ為0～5 min:A=95%,B=5%;5～22 min:A由95%變為2%;22～27 min:A=2%;27～27.5 min:A由2%變為95%;27.5～32 min:A=95%;最終確定對目標物分離效果和靈敏度最優的一組流動相梯度洗脫方式。

1.2.5 質譜條件的確定 將63.84 μg/L的目標物標準溶液用注射器10 μL/min的流速連續注射進入 ESI 離子源,在正離子模式下進行一級質譜分析(Q1 掃描),得到準分子離子峰[M-H-峰],確定母離子后,對離子源溫度、毛細管電壓、脫溶劑氣等參數進行優化,使母離子掃描響應達到最高。再對準分子離子峰進行二級質譜分析,得到響應較高的2個碎片離子分別作為定量離子和定性離子和各自對應的碰撞能量。

1.3 咖啡因的測定

1.3.1 標準儲備溶液的配制 稱量純度為98%的咖啡因標準品407.1 mg,用色譜級甲醇定容至50 mL容量瓶,配制成7.98 mg/mL標準儲備液,溶液轉移至棕色標樣試劑瓶中后在-20 ℃下避光保存。

1.3.2 標準系列工作溶液的配制 精密準確移取標準儲備液,配制濃度為31.92、15.96、7.98、3.99、1.995、0.9975、0.499、0.249 μg/L的系列標準溶液,現用現配。

1.3.3 儀器方法學實驗 將標準品溶液分別日內和日間連續進樣檢測5次,分析咖啡因目標峰面積的日內精密度和線性方程斜率的日間精密度情況。

1.3.4 加標回收率實驗 選擇銀杏葉和銀杏葉提取物進行加標回收率實驗,加標水平是含量的50%和100%,驗證檢測方法的準確性。

1.3.5 精密度和重現性考察實驗 選擇銀杏葉和銀杏葉提取物樣品分別做日內和日間檢測,各檢測5次,分析日內精密度和重現性情況。

1.3.6 線性范圍和檢出限 本研究采用標準曲線進行校準定量,配成一系列標準溶液,濃度為31.92、15.96、7.98、3.99、1.995、0.9975、0.499、0.249 μg/L,以儀器響應峰面積對咖啡因的質量濃度繪制標準曲線。

1.3.7 不同地區銀杏葉和不同批次的銀杏葉提取物中咖啡因含量的評價 選取云南、江蘇邳州、陜西、浙江的銀杏葉和不同批次的銀杏葉提取物樣品進行檢測,按照優化好的超高效液相色譜-串聯質譜儀進行測定,評價其中咖啡因的含量。

1.3.8 銀杏葉提取過程中咖啡因轉移分析 用實驗制備的產品進行咖啡因遷移規律實驗,銀杏葉經溶劑提取、濃縮、萃取、離心、吸附解析后所得銀杏葉提取物[25]。分別測定各個環節的產品中咖啡因含量,根據重量得率計算總體咖啡因含量,以此得出咖啡因轉移規律。

1.3.9 咖啡因殘留量計算方法

式中：Ca指的是銀杏葉提取過程所得到產品的咖啡因質量濃度,單位是mg/kg;Ct指的是銀杏葉中咖啡因的質量濃度,單位是mg/kg;ma指的是銀杏葉提取過程所得到產品的總質量,單位是mg;mt指的是銀杏葉的總質量,單位是mg;A%指的是過程品產中咖啡因含量占銀杏葉中咖啡因的百分比,單位是%。

表2 目標化合物咖啡因的質譜參數Table 2 UPLC-MS/MS parameters for quantitation and confirmation

注:* 定量離子。2 結果與分析

2.1 色譜條件的選擇

根據咖啡因的化學結構,本文采用了三種流動相梯度洗脫方式,實驗結果圖1～圖3所示,其中,梯度洗脫方式Ⅰ需要5 min,梯度洗脫方式Ⅱ需要9 min,梯度洗脫方式Ⅲ需要32 min。且采用梯度洗脫方式Ⅰ的樣品中咖啡因質譜圖的目標峰形明顯優于Ⅱ和Ⅲ,咖啡因在約1.4 min處就可以實現檢測,且雜質不影響咖啡因的出峰。因此選擇流動相梯度洗脫方式Ⅰ是對目標物分離效果和靈敏度最優的一組流動相梯度洗脫方式。

圖1 采用流動相洗脫方式Ⅰ的咖啡因色譜圖Fig.1 Chromatogram of caffeine adoptedmobile phase elution mode of Ⅰ

圖2 采用流動相洗脫方式Ⅱ的咖啡因色譜圖Fig.2 Chromatogram of caffeine adoptedmobile phase elution mode of Ⅱ

圖3 采用流動相洗脫方式Ⅲ的咖啡因色譜圖Fig.3 Chromatogram of caffeine adoptedmobile phase elution mode of Ⅲ

最終確定的液相色譜條件為:流動相A:0.2%甲酸溶液;流動相B:含0.2%甲酸的乙腈;色譜柱:ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×50 mm,2.7 μm);進樣量:5 μL;柱溫:30 ℃;流速:0.3 mL/min;運行時間:5 min;梯度洗脫如表1所示。

表1 流動相梯度洗脫程序Table 1 Mobile phase composition for linear gradient elution

2.2 質譜條件的選擇

最終優化的質譜條件:離子源:電噴霧離子源(ESI);檢測方式:多反應監測(MRM);掃描方式:正離子模式;毛細管電壓:正離子模式,4000 V;離子源溫度:120 ℃;脫溶劑氣流量:700 L/h。目標化合物咖啡因的保留時間、母離子和子離子、碰撞能量見表2。

2.3 標準曲線繪制

表3 儀器檢測精密度Table 3 Intra-precision of instrument

表4 儀器的重現性測試Table 4 Reproducibility test of instrument

表5 銀杏葉及銀杏葉提取物中咖啡因檢測加標回收率Table 5 Recoveries of coffeine in ginkgo and ginkgo extracts

本研究采用標準曲線進行校準定量,配成一系列標準曲線(31.92、15.96、7.98、3.99、1.995、0.9975、0.499、0.249 μg/L),以儀器響應峰面積對咖啡因的質量濃度繪制標準曲線,標準曲線是y=2157.58x+45.0077,相關系數是0.9970。

圖4 咖啡因的標準曲線Fig.4 Standard curve of caffeine

2.4 儀器的方法學考察

2.4.1 日內精密度 將標準品溶液分別日內連續進樣檢測5次,分析咖啡因濃度的日內精密度情況,分析兩天的數據,結果表明:儀器檢測咖啡因峰面積的日內精密度均在3%以內,說明標準品溶液的日內穩定性較好,儀器檢測的日內精密度較高,滿足測試需求。具體見表3。

表6 銀杏葉和銀杏葉提取物中咖啡因檢測日內精密度數據Table 6 The intra-precision data of caffeine in ginkgo and ginkgo extracts

2.4.2 日內精密度 將同一份標準品溶液不同天的檢測咖啡因濃度數據進行匯總,分析標準品溶液的峰面積日間精密度情況,結果表明:儀器檢測標準品溶液的峰面積日間精密度小于5%,說明方法日間精密度較好,儀器檢測的日內精密度較高,滿足測試需求。具體見表4。

2.5 檢測方法準確性驗證

加標回收率考察:選擇云南的銀杏葉及購買不同廠家的銀杏葉提取物分別做加標回收率實驗,驗證檢測方法的準確性。結果表明:使用標準曲線外標法計算的各類樣品的加標回收率基本在90%～110%左右,檢測準確性較高。結果如表5所示。

2.6 檢測方法的方法學驗證

2.6.1 日內精密度驗證 選擇陜西銀杏葉和購買不同廠家的銀杏葉提取物分別做日內檢測,檢測5次,分析精密度情況,結果表明,樣品的日內和日間RSD<10%,滿足檢測需求。

2.6.2 日間精密度驗證 選擇陜西銀杏葉和購買不同廠家的銀杏葉提取物樣品分別做日間檢測,檢測5次,分析精密度情況,結果表明,樣品的日內和日間RSD<10%,滿足檢測需求。

2.6.3 檢測靈敏度 當取樣量為1 g,定容體積為10 mL時,本方法中咖啡因的測定檢出限5 μg/kg;定量限為15 μg/kg。

2.7 銀杏葉及銀杏葉提取物中咖啡因含量評價

2.7.1 不同地區銀杏葉中咖啡因含量評價 采集四個產地的銀杏葉,烘箱烘干后對其進行粉碎,測定其咖啡因含量。結果如表8所示,根據檢測結果可知,不同產地的銀杏葉測定的咖啡因含量不一,可能與生長的氣候、產地有關系。

表7 銀杏葉和銀杏葉提取物中咖啡因檢測日間精密度數據Table 7 The inter-precision data of caffeine in ginkgo and ginkgo extracts

表8 不同產地的銀杏葉中咖啡因檢測數據Table 8 The data of caffeine in ginkgo from different origins

2.7.2 銀杏葉提取物中咖啡因含量評價 如下表9所示,選取市場上不同批次的銀杏葉提取物,檢測其中咖啡因含量,發現銀杏葉提取物中咖啡因含量差別較大,推斷其咖啡因含量高低與銀杏葉中咖啡因含量高低有直接關系,原因可能是由于銀杏葉產地來源不同及提取工藝不同所導致[26]。

表9 銀杏葉提取物中咖啡因檢測數據Table 9 The data of caffeine in different ginkgo extracts

2.7.3 銀杏葉及銀杏葉提取物中的咖啡因轉移規律 通過上述銀杏葉及銀杏葉提取物中咖啡因含量的檢測,發現都存在咖啡因,表明銀杏葉提取物中的咖啡因來源是銀杏葉。為得到合格的產品,實驗室對銀杏葉提取的整個過程進行重現和各個工藝點進行檢測,以期獲得咖啡因的轉移規律。工藝流程如下圖5所示。

圖5 銀杏葉提取物的提取工藝流程Fig.5 Extraction technology process ofginkgo biloba leaf extract

用實驗制備的產品進行咖啡因轉移規律實驗,將100 g銀杏葉經溶劑提取、濃縮、萃取、離心、解析所得銀杏葉提取物進行測定[25]。根據測得各步產品質量和咖啡因質量濃度數據計算各步產品中咖啡因的總質量,求得咖啡因百分比,計算方法參考1.3.9。

實驗結果如表10所示,銀杏葉提取后所得銀杏葉料渣中咖啡因殘留量約為34%,提取液1中咖啡因占比約為66%。將提取液1濃縮后發現濃縮液中咖啡因含量變為約43%,含量降低了約23%,可能是旋蒸時醇溶劑中溶解了一部分咖啡因。濃縮液再經萃取得到的提取液2中咖啡因含量幾乎沒變化,然后提取液2離心后得到的提取液3中咖啡因占比約39%,可能是離心過程中離心渣子中殘留一部分咖啡因,離心液經樹脂吸附解析后,最終得到的銀杏葉提取物中咖啡因占比約為35%。因此,從整個工藝流程看來,銀杏葉中的咖啡因主要是轉移到了料渣和離心渣中,其次是濃縮時轉移到了溶劑中,原料中約35%的咖啡因轉移到了產品中。通過測定兩批咖啡因含量不同的銀杏葉,其銀杏葉提取物中咖啡因含量高低直接和銀杏葉中咖啡因含量高低有關系。

表10 銀杏葉提取過程中咖啡因含量Table 10 The content of caffeine in theprocess of ginkgo biloba extraction

3 結論與討論

采用超高效液相色譜串聯質譜法檢測銀杏葉及銀杏葉提取物中咖啡因含量,該方法簡便快速,5 min內可實現目標物檢測。通過測定各地銀杏葉,發現不同產地的銀杏葉中咖啡因含量是不同的。以此推斷銀杏葉中含有咖啡因,且咖啡因含量高低可能與生長的氣候、產地有關系。

通過對銀杏葉提取過程中半成品進行檢測顯示,銀杏葉提取后所得的銀杏葉渣中咖啡因殘留約占34%,其提取液1中咖啡因約占66%,提取液1濃縮后濃縮液中咖啡因含量約為43%,由于咖啡因易溶于醇[27],可能是旋蒸過程咖啡因溶于溶劑被帶走,濃縮后再經萃取咖啡因含量幾乎沒變化,然后提取液2離心后得到提取液3中咖啡因占比約為39%,可能是離心過程中離心渣中殘留一部分咖啡因,離心液經樹脂吸附解析后,最終得到的產品中咖啡因占比約為35%。因此,銀杏葉中咖啡因主要是轉移到料渣和離心渣中,其次在濃縮時轉移到了溶劑中,原料中約35%的咖啡因轉移到了產品中。實驗證明,銀杏葉中咖啡因是天然存在的,銀杏葉提取物中的咖啡因是銀杏葉中咖啡因部分轉移的結果。因此對銀杏葉提取加工提出以下建議,一是規范原料標準,二是優化生產工藝。